Phát triển quy trình bất hoạt virus bằng formalin trong sản xuất vacxin cúm AH1N109

Hiện nay việc mở rộng sản xuất trên quy mô lớn, trong đó việc phát triển quy trình bất hoạt virus cúm nhằm đảm bảo an toàn cho người sử dụng là vấn đề được quan tâm đầu tư.. Các công ngh

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS Lê Văn Bé - Viện trưởng Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) Nha Trang, ThS Dương Hữu Thái – Trưởng Phòng Vacxin cúm, Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang và ThS Nguyễn Thị Kim Cúc, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các anh chị Phòng vacxin cúm, Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y Nha Trang đã tạo mọi điều kiện tốt nhất có thể cho tôi thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp này

Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua

Nha Trang, tháng 07 năm 2011

Sinh viên

Hà Thị Hoa

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H1N1/09 3

1.2 TỔNG QUAN VỀ VACXIN CÚM 5

1.2.1 Vacxin cúm mùa 5

1.2.2 Các dạng vacxin cúm mùa 5

1.2.2.1 Vacxin cúm bất hoạt (vacxin chết) 5

1.2.2.2 Vacxin sống giảm độc lực 7

1.2.3 Các công nghệ sản xuất vacxin cúm 8

1.2.3.1 Công nghệ sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi 8

1.2.3.2 Công nghệ sản xuất vacxin cúm trên tế bào 9

1.2.3.3 Một số các phương pháp sản xuất vacxin cúm khác 10

1.2.4 Vacxin cúm A/H1N1/09 11

1.3 Quy trình sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09 14

1.3.2 Tiêu chuẩn của vacxin cúm 16

1.4 Các hóa chất thường dùng trong bất hoạt vacxin cúm 16

1.4.1 Beta- propiolactone (BPL) 16

1.4.2 Formalin (Formaldehyde) 17

1.5 Quy trình bất hoạt virus cúm 21

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 22

2.1.1 Vật liệu 22

2.1.2 Dung dịch kháng nguyên virus 22

2.1.3 Thiết bị 22

2.1.4 Dụng cụ và hóa chất 22

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Một số phương pháp kiểm định (test) 25

2.2.1.1 Phương pháp xác định hiệu giá HA (HAU) 25

2.2.1.2 Phương pháp xác định hiệu lực bất hoạt (RIV) 26

2.2.1.3 Phương pháp kiểm tra hàm lượng HA (phản ứng SRID) 27

2.2.1.4 Phương pháp xác định liều gây nhiễm trên trứng gà có phôi (EID50) 28

2.2.2 Phương pháp lấy mẫu sau bất hoạt 29

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu chọn nồng độ formalin thích hợp 29

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu chọn nhiệt độ và thời gian bất hoạt 30

2.2.5 Xây dựng quy trình bất hoạt 32

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Kết quả khảo sát nồng độ formalin bất hoạt 33

3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ và thời gian bất hoạt 36

3.2.1 Kết quả khảo sát hiệu giá HA 37

3.2.2 Kết quả khảo sát EID50 38

3.2.3 Kết quả kiểm tra hiệu lực bất hoạt (RIV) của 3 nhóm nhiệt độ 40

3.2.4 Kết quả khảo sát hàm lượng kháng nguyên (SRID) 41

3.3 Xây dựng quy trình bất hoạt 43

3.3.1 Khảo sát tính ổn định và hiệu quả của quy trình bất hoạt 44

3.3.2 Khảo sát tính an toàn của quy trình bất hoạt 45

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

4.1 KẾT LUẬN 47

4.2 KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(Vaccine bạch hầu – ho gà – uốn ván)

(Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và kiểm định Sinh học, Vương quốc Anh)

(Khuyếch tán miễn dịch vòng đơn)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Ưu điểm, nhược điểm của các loại vacxin .7

Bảng 2.1 Phản ứng ngưng kết hồng cầu trên phiến 96 giếng 26

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát HA của 3 lô thử nghiệm 33

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát RIV của 3 lô thử nghiệm 34

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát SRID của 3 lô thử nghiệm 35

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát hiệu giá HA của các nhóm nhiệt độ trong các khoảng thời gian khác nhau ở 3 lô thử nghiệm 37

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát EID50 của 3 lô thử nghiệm ở các nhóm nhiệt độ trong các khoảng thời gian bất hoạt 39

Bảng 3.6 Kết quả kiểm tra hiệu lực bất hoạt (RIV) của 3 lô sản xuất 40

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát hàm lượng kháng nguyên HA (SRID) của 3 lô ở các nhóm nhiệt độ trong các khoảng thời gian bất hoạt 41

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát HA, SRID, RIV và EID50 của 3 lô sản xuất ở các thời gian khác nhau trong quy trình bất hoạt 44

Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra hàm lượng formalin tồn dư, Endotoxin và Ovalbumin của 3 lô sau khi bất hoạt 45

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Mô hình cấu tạo virus cúm A 3

Hình 1.2 Mô hình các dạng vacxin phòng cúm bất hoạt 6

Hình 1.3 Sơ đồ qui trình sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09 trên trứng gà có phôi 14

Hình 1.4 Sơ đồ quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09 21

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 24

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ formalin 30

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ và thời gian bất hoạt 31

Hình 3.1 Hiệu suất bất hoạt trung bình của 3 lô 35

Hình 3.2 Hàm lượng trung bình kháng nguyên HA của 3 lô thử nghiệm (µg/ml) 42

Hình 3.3 Quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09 43

MỞ ĐẦU

Dịch cúm A/H1N1/09 bùng phát đầu tiên tại Mehico vào cuối tháng 3/2009, đến tháng 4 lan nhanh sang Mỹ và các quốc gia lân cận Chỉ tính đến ngày 17/6/2009, dịch xảy ra trên 86 nước và vùng lãnh thổ ở tất cả các châu lục, với 339.620 người mắc và có 167 người chết, hai nước có số người chết nhiều nhất là Mehico: 08 người và Mỹ: 44 người; Về sau dịch lan nhanh ra hầu hết các nước trên thế giới với số người chết nhiều hơn Điểm đặc biệt của đại dịch cúm này là tốc độ lây lan từ người sang người rất nhanh và những trường hợp tử vong thường rơi vào lứa tuổi từ 20 - 45 tuổi cho thấy tính chất nguy hiểm của dịch Trước tình hình này,

cúm toàn cầu nhằm tìm ra biện pháp kiểm soát và phòng ngừa nguy cơ bùng phát đại dịch

Vacxin là một trong những biện pháp hữu hiệu nhất để phòng ngừa, kiểm soát và đẩy lùi dịch bệnh nói chung và bệnh cúm nói riêng Tuy nhiên, việc sản xuất

ra một lượng vacxin đủ đáp ứng nhu cầu sử dụng trên toàn thế giới còn gặp nhiều khó khăn do năng lực sản xuất ở các quốc gia không đồng đều và những thách thức

về công nghệ Để giải quyết vấn đề này, các nhà sản xuất vacxin tập chung đầu tư nghiên cứu nhiều dạng vacxin cúm khác nhau: Vacxin cúm bất hoạt, vacxin sống và vacxin tái tổ hợp

Viện Vacxin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) đã nghiên cứu sản xuất thành công vacxin cúm A/H1N1/09 bất hoạt trên trứng gà có phôi trên quy mô thí nghiệm Hiện nay việc mở rộng sản xuất trên quy mô lớn, trong đó việc phát triển quy trình bất hoạt virus cúm nhằm đảm bảo an toàn cho người sử dụng là vấn đề được quan tâm đầu tư

Formalin là hóa chất được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới để bất hoạt vi sinh vật trong nhiều loại vacxin cho người Tuy nhiên xác lập quy trình bất hoạt đối với mỗi loại vacxin, sinh phẩm cần được xác định các thông số cụ thể như nồng độ formalin thích hợp là bao nhiêu và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình bất hoạt để

đánh giá tính an toàn và hiệu quả của quy trình Do đó, chúng tôi tiến hành thực

hiện đề tàì: “Phát triển quy trình bất hoạt virus bằng formalin trong sản xuất

vacxin cúm A/H1N1/09”

Mục tiêu của đề tài

1 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09 trong sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09

2 Đánh giá tính an toàn và hiệu quả của quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H1N1/09

Virus cúm A có tên khoa học là Avian Influenza (AI), thuộc họ Orthomyxoviridae trong hệ thống phân loại chung (Basic Taxomomy) Các hạt

virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 - 120 nm Phân tích thành phần hóa học một virion có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 - 75%

là protein; 20 - 24% lipid và 5 - 8% là carbonhydrate Hạt virus có cấu tạo đơn giản

gồm vỏ capsid, vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm [12]

Hình 1.1 Mô hình cấu tạo virus cúm A

Capsde là vỏ protein được cấu tạo bởi các đơn vị hình thái gọi là capsome Capsome lại được cấu tạo từ các đơn vị cấu trúc gọi là protome Vỏ capsid của virus

có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus

Màng ngoài có bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14

nm có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus, bản chất

cấu tạo là glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các thành phần khác của virus Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm Vật liệu di truyền (còn gọi là hệ gene) của virus cúm A là RNA sợi đơn âm (viết tắt là (-) ssRNA), gồm 8 phân đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, Pa, Pb1 và Pb2) nối với nhau thành một sợi duy nhất bên trong vỏ virus Bộ gen nhiều phân đoạn của virus là nguyên nhân dẫn đến

sự thay đổi kháng nguyên liên tục để trở thành chủng virus mới Có hai kiểu thay

đổi kháng nguyên là hoán vị kháng nguyên (antigenic shift) và biến thể kháng nguyên (antigenic driff) Hoán vị kháng nguyên là sự thay đổi di truyền quan trọng

do sự tái tổ hợp gen giữa các chủng khác nhau tạo ra Biến thể kháng nguyên là do đột biến ngẫu nhiên xảy ra ở gen mã hóa cho haemagglutinin dẫn đến sự thay đổi một số acid amin trong protein haemagglutinin [14], [23], [25]

* Neuraminidase (NA)

NA là một glycoprotein, có dạng nút lồi hình cây trên bề mặt vỏ của virus cúm NA có hai phần: phần phía ngoài gồm 4 monomer hình cầu trên cùng mặt phẳng, vùng còn lại là vùng kỵ nước gắn vào màng virus NA có chức năng phân cắt sialic acid bằng cắt các liên kết glycoside nối nhóm keto với D-glactose hoặc D-glactosesamine của acid sialic Phản ứng này cho phép virus vượt qua lớp niêm dịch

để tới được các tế bào biểu mô của đường hô hấp trong quá trình nhiễm trùng Đồng thời việc loại bỏ acid sialic của phân tử NA giúp các virion mới được tổng hợp phóng thích ra ngoài tế bào và gia tăng khả năng gây nhiễm trùng Virus cúm có 9 phân type NA, được kí hiệu từ N1 đến N9 Cho đến nay chỉ có N1, N2 được xác định liên quan đến các vụ dịch ở người [14], [25]

1.2 TỔNG QUAN VỀ VACXIN CÚM

1.2.1 Vacxin cúm mùa

Năm 1931, kỹ thuật nuôi cấy virus trên trứng gà có phôi được phát triển Năm 1941, vacxin cúm bất hoạt lần đầu tiên được sản xuất bằng kỹ thuật này và được phép sử dụng cho quân đội Mỹ trong chiến tranh thế giới thứ 2

Cho tới nay, vacxin cúm mùa chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có phôi Có hai loại vacxin cúm truyền thống là vacxin bất hoạt và vacxin sống

Ngoài ra, vacxin cúm còn được phát triển để sản xuất trên các dòng tế bào,

bao gồm: MDCK, Vero và PER.C6 Các dòng tế bào này có thể nuôi cấy trong môi

trường không có huyết thanh và đã được chấp nhận để sản xuất vacxin cho người Nhờ những tiến bộ của khoa học công nghệ, thế giới đang tiến tới mực tiêu sản xuất vacxin an toàn hơn và đại trà hơn [9], [25]

1.2.2 Các dạng vacxin cúm mùa

Vacxin cúm mùa chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có phôi Có hai loại vacxin cúm truyền thống là vacxin bất hoạt và vacxin sống giảm độc lực

1.2.2.1 Vacxin cúm bất hoạt (vacxin chết)

Hầu hết các loại vacxin cúm hiện nay trên thế giới là vacxin bất hoạt 3 thành phần (kí hiệu TIV) gồm hai chủng cúm A là H1N1, H3N2 và một chủng virus cúm

B Mỗi liều vacxin chứa 15µg kháng nguyên mỗi chủng virus thành phần

TIV gồm các loại: Vacxin toàn thân, vacxin tiểu phần và vacxin kháng nguyên tinh chế

- Vacxin toàn phần virus (whole virus vaccine) là vacxin thế hệ thứ nhất được sản xuất trên trứng gà có phôi, virus được bất hoạt bằng formalin hoặc β-propiolactone Đây là loại vacxin an toàn, dung nạp tốt, hiệu quả bảo vệ 75 – 90 %

- Vacxin mảnh virus (split vaccine) là vacxin thế hệ thứ hai (1968), cũng được sản xuất như vacxin toàn thân nhưng không nguyên vẹn hạt virus mà được tách ra từng mảnh kháng nguyên bề mặt, nucleocapsid, các protein nhờ công đoạn dùng hỗn hợp hóa chất tây rửa tách bớt các lipid vỏ

- Vacxin kháng nguyên tinh chế (subunit vaccine) là thế hệ thứ ba (1976) được sản xuất như vacxin tiểu phần nhưng quy trình tinh chế nghiêm ngặt hơn

vì thế thành phần chính là các protein HA và NA tinh chế, các thành phần khác của virus bị loại bỏ Các kháng nguyên tinh chế này được hoàn nguyên trong các dung dịch lipid tổng hợp virosome Công thức virosome hiện nay đã được cấp phép tại Châu Âu

Để tăng hiệu quả đáp ứng miễn dịch, hiện nay người ta thêm các tá chất trong công thức sản xuất vacxin cúm: MF-59, hợp chất nhôm Đây là hai loại tá chất được cấp phép sử dụng cho vacxin cúm ở Mỹ và Châu Âu [7], [9]

Hình 1 2 Mô hình các dạng vacxin phòng cúm bất hoạt

1.2.2.2 Vacxin sống giảm độc lực

Vacxin sống nhược độc thích ứng lạnh (kí hiệu CAIV) là vacxin khí dung, miễn dịch bằng đường mũi, được sản xuất từ chủng virus có đặc tính thích ứng lạnh

do đột biến Chủng mới sao chép thuận lợi ở 250C nhưng trong cơ thể người (nhiệt

độ 35 - 370C) virus sẽ bị nhược độc Vacxin CAIV hiệu quả cao, miễn dịch liều đơn 0,5 ml và chỉ sử dụng cho người từ 5 - 49 tuổi CAIV được sử dụng ở liên bang Xô Viết cũ trong nhiều năm và tại Mỹ năm 2003 cũng được cấp phép xử dụng

Những nghiên cứu hiện nay tập trung nghiên cứu và sản xuất vacxin DNA từ các mảnh gene của virus: gene HA, NA, NP, NS…Tuy nhiên vẫn chưa xác định được loại vacxin nào hữu hiệu nhất để chống lại tất cả các virus cúm A [7], [21]

Bảng 1.1 Ưu điểm, nhược điểm của các loại vacxin [7]

Loại vacxin Ưu điểm Nhược điểm

Vacxin sống

giảm độc lực

Đơn giản, dễ sản xuất

Giá thành rẻ, tương đối ổn định

Gây miễn dịch kéo dài

Không cần tiêm nhiều lần

Có thể gây ra bệnh nhẹ, có thể lây nhiễm virus

Cần bảo quản lạnh để virus không chết

Tính miễn dịch có thể không cao

Có thể tiêm nhắc lại nhiều lần

Tính miễn dịch có thể không cao

Có thể tiêm nhắc lại nhiều lần

1.2.3 Các công nghệ sản xuất vacxin cúm

Cả hai loại vacxin cúm bất hoạt và sống giảm độc lực đều có thể được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có phôi và trên nuôi cấy tế bào

1.2.3.1 Công nghệ sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi

Nuôi cấy virus trên trứng gà có phôi là phương pháp truyền thống, an toàn, tin cậy và đã được sử dụng để sản xuất vacxin cúm với quy mô công nghiệp trong hơn 60 năm qua, chưa có phương pháp nào thay thế được

Trứng gà có phôi 9 - 12 ngày tuổi được sử dụng để cấy virus Sau khi gây nhiễm virus, ủ trứng ở nhiệt độ 33,50C, có độ ẩm 60 - 70% Sau 72 giờ chuyển trứng vào buồng lạnh (40C) để qua đêm nhằm diệt phôi và làm co mạch máu Ngày hôm sau thu hoạch dịch niệu nang rồi tiến hành các công đoạn tinh khiết virus và bất hoạt [1], [5]

* Ưu điểm của công nghệ sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi

- Đây là phương pháp sản xuất chuẩn thức được sử dụng rộng rãi hiện nay Với công nghệ này, hàng trăm triệu liều vacxin cúm đã được sản xuất và được sử dụng an toàn trên thế giới

- Những chủng virus dùng trong sản xuất vacxin cúm đã được tối ưu hóa để phát triển trên trứng Vấn đề giấy phép cũng như những phân tích cần thiết đã được thiết lập và có những chứng cứ thuyết phục

- Vốn đầu tư ban đầu để xây dựng nhà máy sản xuất ở qui mô vừa và nhỏ, giá thành vacxin tương đối rẻ

* Nhược điểm của công nghệ sản xuất vacxin cúm trên trứng gà có phôi

- Đây là một dây chuyền riêng biệt cho việc sản xuất chỉ một loại vacxin cúm Nếu nhu cầu vacxin cúm đột ngột giảm xuống không tận dụng được cơ sở vật chất

đã được nâng cấp sang sản xuất loại vacxin khác vì thế phải tính toán chi tiết khi đầu tư mở rộng sản xuất

- Nguồn cung cấp trứng sẽ hạn chế đặc biệt khi dịch xảy ra trên gà

- Chất thải rắn trong qui trình sản xuất sẽ chiếm 80% lượng nguyên liệu cung cấp Cần phải có hệ thống sử lý thích hợp

- Năng suất vacxin sản xuất trên trứng: mỗi một chủng virus có những đặc tính phát triển trên trứng khác nhau [1], [3], [5]

1.2.3.2 Công nghệ sản xuất vacxin cúm trên tế bào

Hiện nay có một số dòng tế bào đang được dùng trong nghiên cứu sản xuất vacxin cúm: MDCK (tế bào thận chó Madin-Darby) được phân lập vào năm 1958

và được sử dụng rộng rãi trong sản xuất vacxin cho súc vật; Vero (tế bào thận khỉ xanh châu Phi) đã được dùng để sản xuất vacxin bại lệt trong hơn 20 năm; PER.C6 (tế bào võng mạc người) là dòng tế bào mới được sử dụng trong nuôi cấy tế bào

Các dòng tế bào khác: Một vài dòng tế bào khác có thể phù hợp đối với việc sản xuất vacxin cúm Tế bào nguyên bào sợi phôi gà (đã được dùng để sản xuất vacxin sởi) có năng suất tốt với virus cúm Dòng tế bào Vivalis có nguồn gốc từ gà (Nantes, Pháp), đang được nghiên cứu trong vài năm gần đây cũng cho thấy có nhiều hứa hẹn [1], [3]

* Ưu điểm của công nghệ sản xuất vacxin cúm trên tế bào

Nuôi cấy virus cúm trên tế bào sẽ khắc phục được một số nhược điểm của phương pháp sản xuất trên trứng gà có phôi Những thuận lợi của phương pháp này

so với phương pháp sản xuất trên trứng gà có phôi bao gồm:

- Không cần phải dùng đến lượng trứng gà lớn Nguồn cung cấp nguyên liệu bảo đảm và có thể dự trữ

- Quy trình này có thể tăng quy mô lên nhanh chóng do sử dụng được công nghệ trong nhà máy sản xuất các vacxin khác trên tế bào

- Nâng cao khả năng vô trùng trong quá trình sản xuất Tránh được nguy cơ trứng có phôi nhiễm retrovirus

- Vacxin không có thành phần trứng nên tránh được nguy cơ dị ứng cho những người có tiền sử dị ứng với protein của trứng

* Nhược điểm của công nghệ sản xuất vacxin cúm trên tế bào

- Chi phí sản xuất vacxin cúm trên tế bào cao hơn so với phương pháp truyền thống Các quy trình kiểm định phức tạp hơn như phải phát hiện DNA của tế bào chủ Những kỹ thuật này đòi hỏi phương tiện và phải chuẩn thức

- Tốn thời gian và chi phí để phát triển đủ lượng tế bào cho sản xuất từ ngân hàng tế bào gốc

- Các tế bào dùng để sản xuất vacxin thường yêu cầu phải có hồ sơ mô tả toàn

bộ đặc tính của tế bào và hồ sơ về ngân hàng tế bào gốc của nhà sản xuất, mà chúng thường được cấp sở hữu trí tuệ nên đòi hỏi phải xin giấy phép [1], [3], [24]

1.2.3.3 Một số các phương pháp sản xuất vacxin cúm khác [5], [15]

- Nuôi cấy trên nguyên bào sợi phôi gà

Đây có thể là phương pháp nhanh nhất để mở rộng quy mô sản xuất vacxin cúm, áp dụng đối với các nhà sản xuất đã sử dụng phương pháp này trong sản xuất các vacxin khác

Phương pháp sản xuất này cần sự đầu tư vừa phải về kinh phí và thời gian Tuy nhiên phương pháp này cũng có những bất lợi như đòi hỏi phải có trứng sạch

SPF, huyết thanh bào thai bê …

- Vacxin DNA

Vacxin chứa DNA của HA và NA được tiêm trong da dưới dạng đạn bọc DNA (hãng PowderMed, Oxford Anh) Vì DNA có thể được sản xuất nhanh chóng cho nên vacxin này đang thu hút sự quan tâm của các nhà chuyên môn Tuy nhiên quy trình công nghệ phức tạp và quyền sở hữu trí tuệ gây khó khăn cho việc triển khai rộng rãi loại vacxin này

- Vacxin HA theo kiểu vector và tái tổ hợp

Kháng nguyên HA được sản xuất bởi hệ thống virus baculo (hãng Protein

Sciences Corporation, Mỹ) hoặc trong thực vật cấy DNA của virus (hãng Microbix, Mỹ) Ưu điểm của dạng vacxin này là năng xuất kháng nguyên cao và sản xuất nhanh Tuy nhiên khả năng đáp ứng miễn dịch bị hạn chế

Các chuyên gia đã tổng kết các công nghệ khả thi nhằm sớm đưa sản phẩm ra thị trường Tựu chung, nguyên lý công nghệ phải trải qua mấy công đoạn chính sau:

- Thống nhất các chủng giống (do những phòng thí nghiệm chuẩn của TCYTTG cung cấp)

- Nuôi cấy virus (trên trứng gà có phôi hoặc tế bào)

- Thu kháng nguyên (toàn tế bào bất hoạt, mảnh kháng nguyên hoặc kháng nguyên tinh chế, vacxin virus sống nhược độc)

- Tá dược: Phổ biến dùng muối nhôm, nhũ tương dầu trong nước (MF-59, Squalence…)

- Công thức hỗn hợp: Hàm lượng kháng nguyên (từ 3,7 µg HA đến 15 µg/liều)

- Công ty CSL Biotherapies (Úc, Arkville) sản phẩm loại đơn giá - không dạng split từ chủng NYMC X-179 (USA-New york Medical College) trên trứng gà

có phôi, bất hoạt bằng thiomersal (0,01% w/v), hàm lượng 15 µg/liều 0,25 ml thử cho người từ 15 - 64 tuổi (240 người) chia 2 nhóm dưới 50 và trên 50 tuổi, liều 15 -

30 µg/ngẫu nhiên, tiêm bắp, lấy máu làm HI (Haemagglutination Inhibition) và trung hoà vi lượng sau 21 ngày, mức kháng thể HI = 1/40 làm chuẩn Phản ứng phụ 64,7% ở mức trung bình

Những thử nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu quả vacxin cúm A/H1N1 đang được thực hiện ở nhiều nơi, có 45 nghiên cứu đã được tiến hành tính đến ngày 30/9/2010 [17], [28]

Vacxin của hãng CSL sử dụng chủng NYMC X-179A đang được đánh giá thực địa ở giai đoạn II Vào ngày thứ 21 sau khi tiêm vacxin những người tình nguyện được lấy máu nhằm xác định mức chuyển đổi huyết thanh (HI) kết quả cho thấy: nhóm người được nhận liều 15 µg có 96,7% (khoảng tin cậy 95% là 91,7 - 98,7) đối tượng đạt HI 1: 40; nhóm người được nhận liều 30 µg có 93,3% (khoảng tin cậy 95% là 87,4 - 96,5) đối tượng đạt HI 1: 40

Chủng vacxin của hãng Novatis được tạo ra bằng phương pháp di truyền ngược, những đoạn gen mã hoá cho Haemagglutinin, Neuraminidase và Polymerase B1 có nguồn gốc từ chủng A/California/7/2009 Những gen còn lại được lấy từ chủng virus cúm A/PR8/8/34 Vacxin chứa các kháng nguyên bề mặt của virus cúm, chất bảo quản thiomersal được ly tâm loại bỏ còn lại rất ít (≤ 1 µg thủy ngân/liều 0,5 ml, ovalbumin ≤ 1 µg, polymyxin ≤ 3,75 µg, neomyxin ≤ 2,5 µg, ß-propiolactone < 0,5 µg và nonylphenol ethoxylate < 0,015%) Vacxin có hoặc không kèm tá chất MF-59 một loại nhũ tương làm từ squalene [17] Tá chất MF-59 tạo ra đáp ứng kháng thể trong vòng 14 ngày sau khi thực hiện 1 liều tiêm duy nhất Nghiên cứu được thiết kế để đánh giá thực địa giai đoạn 1 với 175 người tham gia (18 - 50 tuổi) Các phác đồ tiêm như sau: 2 mũi vacxin không hấp phụ được tiêm bắp (7,5 µg HA) vào 2 cánh tay hoặc 1 mũi tiêm vào ngày đầu, mũi còn lại cách mũi đầu 7, 14 hoặc 21 ngày

- 2 mũi tiêm vacxin hấp phụ tá chất MF-59 (3,75 µg HA /liều)

- 2 mũi tiêm 7,5 µg HA và 15 µg HA được tiêm cách nhau 21 ngày

- Vacxin của hãng Sanofi-Aventis loại bất hoạt một thành phần dùng tiêm bắp sản xuất từ trứng gà có phôi Vacxin chứa 15 µg HA của chủng virus A/California/07/2009 (H1N1) cho liều 0,5 ml Chất ổn định được thêm vào là gelatin 0,05% Mỗi liều vacxin 0,5 ml chứa một lượng formalin tồn dư không quá 100 µg,

polyethylene glycol ether (≤ 0,02%) và sucrose (≤ 2,0%) Chất bảo quản thimerosal được phép có mặt trong vacxin đa liều, hàm lượng 25 µg

Vacxin của hãng GSK (Bỉ) là loại mảnh kháng nguyên (split) một thành phần (monovalent) được tạo ra từ chủng A/California/07/2009 (X-179A) cũng được sản xuất trên trứng gà có phôi Vacxin chứa 3,7 µg HA và có kèm tá chất ASO3, một loại nhũ tương làm từ hợp chất squalene, trong thành phần vacxin có thiomersal

Ở Việt Nam, hiện có 3 nơi được phép tiến hành nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09 Tại Trung tâm Nghiên cứu sản xuất Vắcxin và Sinh phẩm Y Tế (Polyvac) người ta đang tiến hành nghiên cứu quy trình sản xuất vacxin bất hoạt từ chủng X-179 A bằng tế bào Vero hấp phụ trên hydroxit nhôm

Công ty Vắcxin và sinh phẩm số 1 (Vabiotech - Hà nội) thực hiện đề tài cấp nhà nước xây dựng qui trình sản xuất vacxin A/H1N1/09 trên tế bào thận khỉ cũng đạt được những thành công bước đầu [1], [11]

Viện Vắcxin và Sinh Phẩm Y tế (IVAC) đã sản xuất thành công trên quy mô thí nghiệm và đã phát triển sản xuất trên quy mô lớn

1.3 Quy trình sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09 [5], [23]

Hình 1.3 Sơ đồ qui trình sản xuất vacxin cúm A/H1N1/09 trên trứng gà có phôi

Vacxin

Bất hoạt, ly giải, lọc vô trùng

Siêu ly tâm phân đoạn sucrose

1.3.1 Tiêu chuẩn của vacxin [8], [9]

Hai tiêu chuẩn quan trọng nhất của vacxin là an toàn và hiệu lực

* An toàn

Một vacxin lý tưởng khi sử dụng sẽ không gây bệnh, không gây độc và không gây phản ứng nghiêm trọng Sau khi sản xuất vacxin phải được cơ quan kiểm định nhà nước kiểm tra chặt chẽ về mặt vô trùng, thuần khiết và không độc

- Vô trùng: Vacxin không được nhiễm các vi sinh vật khác

- Thuần khiết: Ngoài kháng nguyên đưa vào để kích thích cơ thể đáp ứng miễn dịch chống vi sinh vật gây bệnh, không được lẫn các thành phần kháng nguyên khác

có thể gây ra các phản ứng phụ bất lợi

- Không độc: Liều sử dụng phải thấp hơn rất nhiều so với liều gây độc

Tuy nhiên, không có vacxin nào đạt được độ an toàn tuyệt đối Về nguyên tắc, vacxin phải đảm bảo đủ độ an toàn Song trên thực tế không thể đạt được mức

độ an toàn tuyệt đối Tất cả các vacxin đều có thể gây ra phản ứng phụ ở một số người

* Hiệu lực

Vacxin có hiệu lực lớn là vacxin gây được miễn dịch ở mức độ cao và tồn tại trong một thời gian dài Hiệu lực gây miễn dịch của vacxin trước hết được đánh giá trên động vật thí nghiệm, sau đó trên thực địa

Trên động vật thí nghiệm:

Cách thứ nhất, đánh giá mức độ đáp ứng miễn dịch thông qua việc xác định hiệu giá kháng thể hoặc xác định mức độ dương tính của phản ứng da Cách đánh giá này chưa cho biết hiệu lực bảo vệ, mới chỉ cho biết mức độ đáp ứng miễn dịch của cơ thể động vật đối với loại vacxin thử nghiệm Cách thứ hai, xác định tỷ lệ động vật đã được tiêm chủng sống sót sau khi thử thách bằng vi sinh vật gây bệnh Trên thực địa:

Dù đã được cơ quan kiểm định nhà nước kiểm tra và đã được đánh giá trên động vật, trước khi đưa ra tiêm chủng rộng rãi, vacxin đều phải được thử nghiệm trên thực địa: Vacxin được tiêm chủng cho một cộng đồng, theo dõi thống kê tất cả các phản ứng phụ và đánh giá khả năng bảo vệ khi mùa dịch tới

Ngoài 2 tiêu chuẩn trên, để chọn một vacxin tiêm chủng, người ta còn quan tâm đến giá thành và tính thuận lợi trong việc tiến hành tiêm chủng

1.3.2 Tiêu chuẩn của vacxin cúm

Cũng như các loại vacxin khác, vacxin cúm cũng cần đảm bảo được hai tiêu chuẩn trên Đối với giai đoạn bất hoạt thì tiêu chuẩn an toàn cần được đảm bảo hàng đầu Trong đó các chỉ tiêu, tiêu chuẩn như sau:

- Vô trùng

- Endotoxin ≤ 200 EU/ml

- Ovalbumin ≤ 1,0 µg/ml

- Formalin tồn dư ≤ 0,02%

- An toàn đặc hiệu: có ít nhất 8/10 trứng gà có phôi sống sau khi được cấy

truyền dịch virus bất hoat và không còn khả năng ngưng kết hồng cầu

1.4 Các hóa chất thường dùng trong bất hoạt vacxin cúm

Yêu cầu khi sản xuất vacxin là phải an toàn cho người sử dụng Do đó các

vi sinh vật sử dụng để chế tạo vacxin phải không còn khả năng gây bệnh nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên, nghĩa là có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể

Vi sinh vật có thể được bất hoạt bằng các tác nhân hóa học: formalin, beta propiolactone… hay tác nhân lý học (tia cực tím, nhiệt độ…)

1.4.1 Beta - propiolactone (BPL) [22], [23]

Beta - propiolactone (C3H4O2) là hợp chất hữu cơ thuộc họ lactone, ở trạng thái lỏng không màu có mùi hăng, vị ngọt BPL hòa tan trong nước và có thể trộn lẫn với rượu, axeton, ete, và hầu hết các dung môi phân cực và chất béo BPL có khả năng tự thủy phân thành acid hydracrylic trong nước, nhưng ổn định khi bảo quản ở 50C trong lọ thủy tinh BPL có cấu trúc vòng bốn cạnh nên có thể thực hiện phản ứng nở vòng ở cả hai vị trí alkyl và acyl làm cho nó dễ dàng phản ứng với protein (chủ yếu là methionine, cysteine) và acid nucleic (phần lớn là guanine)

Ưu điểm của BPL

- Bất hoạt virus nhanh, hiệu quả

- BPL có thể bị phân hủy ngay sau vài giờ sử dụng nên ít nguy hiểm

Nhược điểm

- BPL ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe con người

- BPL tan trong nước nên rất khó thao tác và nguy hiểm khi sử dụng

- Giá thành cao

Hiện nay BPL cũng đang được sử dụng để bất hoạt virus cúm tại Viện Vắcxin Hà lan (NVI)

1.4.2 Formalin (Formaldehyde)

Formalin là tên thương phẩm của formaldehyde, một aldehyde đơn giản nhất

có công thức phân tử H2CO, có thể tồn tại dưới dạng C3H6O3 (trioxane) và dạng polymer paraformaldehyde Trong nước, formalin ở dạng H2C(OH)2 Formalin là sản phẩn trung gian khi đốt methane hay các hợp chất chứa carbon khác Trong không khí, formalin được tạo ra do phản ứng của oxy với methane hay các hydrocarbon dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời

Ở nhiệt độ phòng, formalin ở dạng khí, dễ hoà tan trong nước với nồng độ khoảng 37%, bền vững với methanol 10 - 15% Trong nước, đa phần formaldehyde được chuyển thành dạng hydrate hoá CH2(OH)2 hay methanediol [13], [26]

a, Cơ chế bất hoạt virus của formalin [13], [16]

Formalin đã được sử dụng để bất hoạt vi sinh vật trong nhiều năm qua Cơ chế tác động của formalin đối với các vi sinh vật như sau:

- Formalin có phản ứng rất mạnh, có thể kết hợp với acid nucleic và protein và làm bất hoạt chúng, còn có thể làm bất hoạt thông qua việc liên kết

chéo (crosslinking) và alkyl hóa (alkylating) nhóm -NH2, -SH của protein và

vòng nitrogen trong các base purin

- Formalin phản ứng với các nhóm amino tự do của phân tử protein độc (chủ yếu là nhóm lysine và các phân tử hai đầu chứa nhóm NH2) Ngoài ra, formalin còn

phản ứng với các nhóm protein khác như là: nhóm imidazole của histidine, nhóm hydroxyle của tyrosine và nhóm indole của trypthophane …Tuy nhiên, không phải phản ứng xảy ra ở tất cả các nhóm, phản ứng còn phụ thuộc vào các yếu tố tác động bên ngoài như pH môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng…

- Phản ứng giữa formalin với amine chính hay amine thứ cấp:

Amine chính: R-NH2 + OCH2 R-NH-CH2OH R-N=CH2 + H2O Amine thứ cấp: RR’-NH + OCH2 RR’-N-CH2OH

- Phản ứng amino acid với formalin:

R-CH-NH3 + OCH2 R-CH-NH-CH2OH R-CH-N=CH2 + H2O

COO- COO- + H+

Phản ứng làm thay đổi các mối liên kết trong phân tử protein dẫn đến bất hoạt chúng

b, Ưu và nhược điểm của formalin

- Thời gian phân giải chậm nên quá trình bất hoạt kéo dài

- Hàm lượng formalin cao ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe con người

c, Tình hình sử dụng formalin [3], [16]

Formalin là một hóa chất bất hoạt truyền thống Năm 1923 vacxin giải độc tố bạch hầu do Gleumy - Ramon bất hoạt bằng formalin ra đời, tiếp sau đó là các vacxin vi khuẩn bất hoạt bằng formalin (vacxin tả, ho gà, thương hàn…) và các

hiệu quả nên formalin vẫn được các nhà sản xuất sử dụng, gần đây nhất là formalin được sử dụng thành công trong bất hoạt virus cúm sản xuất vacxin cúm A/H5N1 Theo khuyến cáo của WHO thì hóa chất bất hoạt virus là formalin hay beta-propiolacton đều được phép sử dụng trong sản xuất vacxin, nhưng không được vượt quá nồng độ cho phép (nồng độ theo thể tích không được vượt quá 0,1% bất kỳ lúc nào trong quá trình bất hoạt) Hàm lượng formalin tồn dư không được vượt quá 0,02% [2], [23]

Dựa vào đó, IVAC đã tiến hành nghiên cứu sản xuất vacxin cúm A/H1N1 bất hoạt bằng formalin trên trứng gà có phôi ở quy mô phòng thí nghiệm

Tuy nhiên, khi phát triển công nghệ sản xuất quy mô công nghiệp cần phải xem xét các yếu tố:

- Thời gian bất hoạt

- Hiệu giá HA trước và sau bất hoạt

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng tới hiệu quả bất hoạt virus của formalin bao gồm: nồng độ formalin, nhiệt độ, thời gian bất hoạt và các yếu tố khác (pH môi trường, tốc độ khuấy đảo )

- Nồng độ formalin là một trong số 3 yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất trong quá trình bất hoạt Ở nồng độ formalin cao khả năng bất hoạt virus càng tốt, song đến một nồng độ nào đó formalin có thể phá hủy các kháng nguyên của virus, đồng thời lượng formalin tồn dư trong quá trình bất hoạt nhiều ảnh hưởng không tốt tới chất lượng vacxin Ở nồng độ formalin thấp khả năng bất hoạt virus kém, kéo dài thời gian bất hoạt hoặc virus không được bất hoạt hoàn toàn, hiệu lực bất hoạt không đạt Vì vậy, nồng độ formalin lựa chọn phải đảm bảo bất hoạt virus hoàn toàn, không làm ảnh hưởng tới kháng nguyên của virus, lượng formalin tồn dư sau bất hoạt thấp, thời gian bất hoạt thích hợp

- Nhiệt độ bất hoạt không những ảnh hưởng tới khả năng bất hoạt của formalin

mà còn ảnh hưởng tới kháng nguyên của virus Ở nhiệt độ cao, formalin có thể bị biến đổi cấu trúc và giảm hoạt động, kháng nguyên của virus có thể bị ảnh hưởng vì bản chất kháng nguyên là các protein Nhiệt độ thấp có thể làm giảm hoạt động của

formalin dẫn đến kéo dài thời gian bất hoạt Tuy nhiên ở nhiệt độ 2 - 80C lại giúp ổn định kháng nguyên của virus

- Thời gian bất hoạt: Thời gian bất hoạt càng dài thì khả năng bất hoạt càng tốt, song có thể ảnh hưởng tới kháng nguyên của virus, làm tăng thời gian sản xuất Ngược lại, thời gian bất hoạt ngắn sẽ làm giảm thời gian sản xuất nhưng virus có thể chưa được bất hoạt hoàn toàn

- Các yếu tố khác: Tốc độ khuấy đảo, pH dung dịch, độ nhớt của dung dịch cũng ảnh hưởng không nhỏ tới hiệu quả của quá trình bất hoạt Tốc độ khuấy đảo làm tăng khả năng tiếp xúc của formalin với virus, giúp quá trình bất hoạt xảy

ra nhanh, đồng đều; Độ nhớt của dung dịch có ảnh hưởng tới khả năng khuấy đảo

và khả năng tiếp xúc của formalin với virus

1.5 Quy trình bất hoạt virus cúm

Hình 1.4 Sơ đồ quy trình bất hoạt virus cúm A/H1N1/09

(theo quy trình bất hoạt hiện tại của IVAC)

Để mở rộng sản xuất vacxin trên quy mô lớn thì việc phát triển quy trình bất hoạt sao cho phù hợp là vô cùng quan trọng, nhằm đảm bảo an toàn cho người sử dụng, rút ngắn thời gian và tăng hiệu quả sản xuất

Lọc trước bất hoạt

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vật liệu

- Trứng gà sạch có phôi 11 ngày tuổi do trại chăn nuôi Suối Dầu cung cấp

- Chủng virus NYMC X-179A tái tổ hợp có nguồn gốc từ chủng A/Califonia/7/2009, mã số 09/124, do Viện NIBSC (Vương quốc Anh) cung cấp

2.1.2 Dung dịch kháng nguyên virus

Dung dịch kháng nguyên virus trước bất hoạt được sản xuất theo quy trình của IVAC bao gồm 3 lô liên tiếp:

- Lô VXC/H1-1: Hiệu giá HA trước bất hoạt là 20480 HAU/ml

- Lô VXC/H1-2: Hiệu giá HA trước bất hoạt là 20480 HAU/ml

- Lô VXC/H1-3: Hiệu giá HA trước bất hoạt là 10240 HAU/ml

2.1.3 Thiết bị

- Tủ ấm 350C (hãng JEIO TECH/ Hàn Quốc)

- Tủ lạnh 2 - 80C (hãng ACSON/ Hàn Quốc)

- Máy lắc (IKA)

- Tủ cấy an toàn sinh học cấp 2 (ESCO)

- Máy khuấy từ (IKA)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Khảo sát tính an toàn

Nghiên cứu nhiệt độ

và thời gian bất hoạt

RIV EID50 SRID

RIV EID50

Formalin tồn dư

Ovalbumin Endotoxin

2.2.1 Một số phương pháp kiểm định (test)

2.2.1.1 Phương pháp xác định hiệu giá HA (HAU) [23]

a Nguyên lý

Kháng nguyên haemaglutinin của virus cúm có khả năng ngưng kết hồng cầu của động vật máu nóng Phản ứng này giúp xác định được sự có mặt của kháng nguyên HA trong mẫu thử

b Thực hiện

- Pha loãng mẫu 1/10

- Cho 50 µl PBS + 0,5% BSA vào tất cả các giếng của phiến

- Cho mẫu đã pha loãng vào phiến chữ U

- Cho chứng âm (-): dung dịch PBS

- Cho chứng dương (+): dịch chủng virus

- Pha loãng bậc 2 trên phiến chữ U

- Thêm 50 µl hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng của phiến

- Lắc nhẹ sau đó để yên phiến trong nhiệt độ phòng từ 30 phút đến 4 giờ

Bảng 2.1 Phản ứng ngưng kết hồng cầu trên phiến 96 giếng

Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Chứng