Để khảo sỏt tớnh an toàn của quy trỡnh bất hoạt, chỳng tụi tiến hành kiểm tra hàm lượng formalin tồn dư, hàm lượng endotoxin (nội độc tố) và hàm lượng ovalbumin cú trong dung dịch virus sau bất hoạt.
Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra hàm lượng formalin tồn dư, Endotoxin và Ovalbumin của 3 lụ sau khi bất hoạt
Test Lụ số Formalin (%) Endotoxin (EU/ml) Ovalbumin (ààààg/ml) VXC/H1-01 0,002 25 0,017 VXC/H1-02 0,0085 25 0,015 VXC/H1-03 0,0069 30 0,012 Trung bỡnh 0,0071 26,67 0,015 Tiờu chuẩn ≤ 0,02% ≤ 100 ≤ 1
Qua bảng 3.9 cho thấy, kết quả bất hoạt virus theo quy trỡnh mới đạt cỏc chỉ tiờu về nồng độ formalin tồn dư, endotoxin và ovalbumin theo khuyến cỏo của WHO và dược điển Việt Nam.
Như vậy, quy trỡnh bất hoạt virus mới khụng những hiệu quả và ổn định mà cũn đảm bảo tớnh an toàn. Do đú, việc sử dụng quy trỡnh bất hoạt virus cỳm mới vào trong sản xuất vacxin cỳm A/H1N1/09 ở quy mụ lớn là rất phự hợp
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN
1. Xỏc định được nồng độ formalin, nhiệt độ và thời gian bất hoạt là cỏc yếu tố chớnh ảnh hưởng tới quỏ trỡnh bất hoạt virus cỳm A/H1N1/09. Nồng độ formalin 0,02%, nhiệt độ bất hoạt 20 - 240C, thời gian bất hoạt 96 giờ là cỏc thụng số thớch hợp nhất để bất hoạt virus cỳm A/H1N1/09 đạt hiệu quả và an toàn.
2. Quy trỡnh bất hoạt virus cỳm A/H1N1/09 của Đề tài được đỏnh giỏ là an toàn và hiệu quả theo tiờu chuẩn của WHO và dược điển Việt Nam. Cỏc chỉ tiờu đạt được như sau:
- Vụ trựng
- Hàm lượng HA đạt 150 - 200 (àg/ml) - Endotoxin ≤ 100 EU/ml
- Ovalbumin ≤ 1,0 àg/ml - Formalin tồn dư ≤ 0,02%
- An toàn đặc hiệu: cú ớt nhất 8/10 trứng gà cú phụi sống sau khi được cấy truyền dịch virus bất hoat và khụng cũn khả năng ngưng kết hồng cầụ
4.2. KIẾN NGHỊ
1. Ứng dụng quy trỡnh bất hoạt virus cỳm của Đề tài để sản xuất vacxin cỳm A/H1N1/09 ở quy mụ lớn.
2. Tiến hành nghiờn cứu cỏc yếu tố khỏc ảnh hưởng tới quỏ trỡnh bất hoạt như tốc độ khuấy đảo, lọc trước và sau bất hoạt...nhằm đạt được hiệu suất bất hoạt tốt nhất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Bộ Khoa học Cụng nghệ (2006), Nghiờn cứu qui trỡnh sản xuất vắcxin cỳm A/H5N1 bất hoạt dựng cho người bằng kỹ thuật nuụi cấy trờn tế bào vero và trờn trứng gà cú phụi, thuyết minh đề tài nghiờn cứu cấp nhà nước, thành phố Hồ Chớ Minh, trang 2 - 24.
2. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt nam tập III, nhà xuất bản Y học, Hà Nội 2002. 3. Nguyễn Đăng Hiền, Đặng Mai Dung, Nguyễn Thị Quỳ, Vũ Cụng Long, Nguyễn
Huy Phương, Trần Bớch Hạnh, Lờ Trung Dũng, Ngụ Thu Hường, Lờ Thị Luõn (2010), “Thử nghiệm vắcxin cỳm A/H1N1 sản xuất tại POLYVAC trờn khỉ M.Mulatta”, Tạpchớ Y học Dự phũng, tập XX, số 7 (115), trang 29 - 35.
4. Lờ Văn Hiệp (2007), “Vắcxin cỳm A/H5N1 nào cho người Việt nam”, Tạp chớ Y học Dự phũng, Hà nội, tập XVII số 3 (88), trang 44 - 49.
5. Lờ Văn Hiệp, Lờ Văn Bộ, Nguyễn Thị Minh Hiền, Nguyễn Thị Lan Phương, Đặng Hồng Võn (2007), “Nghiờn cứu sản xuất vắcxin cỳm A/ H5N1 cho người trờn trứng gà cú phụi từ chủng NIBRG-14 tại Viện Vắcxin”, Tạp chớ Y học Dự phũng, Hà nội, tập XVII, số 5 (90), phụ bản, trang 52 - 57.
6. Lờ Văn Hiệp, Đặng Thị Hồng Võn (2007), “Thử nghiệm cỏc loại tỏ chất cho vắcxin cỳm A/H5N1”, Tạp chớ Y học Dự phũng, Hà nội, tập XVII, số 6 (91), trang 5 - 9.
7. Lờ văn Hiệp và cộng sự (2008), Nghiờn cứu qui trỡnh sản xuất vắcxin cỳm A/H5N1 bất hoạt dựng cho người bằng kỹ thuật nuụi cấy trờn trứng gà cú phụi, Bỏo cỏo kết quả nghiờn cứu đề tài cấp nhà nước, Hà nộị
8. Lờ Văn Hiệp (2009), Bệnh cỳm và vắcxin, Nhà xuất bản y học, Hà nội, trang 66 - 88.
9. Lờ Văn Hiệp (2006). Vacxin học những vấn đề cơ bản, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, trang 55 - 62.
10. Nguyễn Thị Thi Thơ và cộng sự (2010), “Một số đặc điểm dịch tễ học của 50 trường hợp tử vong đầu tiờn do cỳm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt nam”, Tạp chớ Y học Dự phũng, Hà nội, tập XX, số 3 (111), trang 40 - 45.
11. Nguyễn Thu Võn, Hoàng Thuỷ Nguyờn, Đỗ Thuỷ Ngõn, Nguyễn Tuyết Nga, Nguyễn Hoàng Mai, Trịnh Tuấn Việt, Đinh Thuý Võn, Lờ Quỳnh Mai, Nguyễn Lờ Khỏnh Hằng (2006), “Đỏnh giỏ tớnh an toàn và đỏp ứng miễn dịch của vắcxin cỳm A/H5N1 (FLUVAX) trờn động vật thực nghiệm”, Tạp chớ Y học thực hành, số 7, trang 3 - 4.
12. Phạm Văn Ty (2005), Virus học, Nhà xuất bản giỏo dục, Hà Nội, trang 205 - 213.
TIẾNG ANH
13. Dr RudyH. Tiesjema (1998), Backgounds of Production of DTP Group Vaccine, RIVM/BIS/VaccineTechnology Transfer Centre, Pages 6 - 20.
14. C. Russell , R . Webster (2005), “The Genesis of a Pandemic Influza Virus”, Cell, Vol 123, Issue 3, Pages 368 - 371.
15. Center for Disease control and Prevention, Department of Health & Human services (2009), Novel Influenza A (H1N1) candidate vaccine virus and biocontainment requirements for handling, Wasinhton, USẠ
16. Europian Pharmacopean (2001), Inactivated Influenza vaccine (WHOle virion), London, Pages 59 - 74.
17. Jose Luis Valdespino-Gomez, Luordes Garcia-Garcia and Samuel Ponce de Leon-Rosales (2009), Vaccines against Influenza A (H1N1) Pandemic, Archives of Medical Research 40, Pages 693 - 704.
18. Laszlo Palkonyay (2007), Influenza vaccine production capacity Buiding in developing countries: Summary of WHO programme, Initiative for vaccine research Global pandemic action plan advisory group meeting, WHO HQ Genevạ
19. Le Van Hiep (2006), Human influenza vaccine (A/H5N1)–Pilot Production and Development, Plan at IVAC, Joint Mid-Term Review Meeting Prevention and Control of Avian Influenza, Manila, Philippin.
20. Le Van Hiep (2007), Study on Human influenza vaccine (A/H5N1) production at IVAC. The initatiative for vaccine reseach (IVR) & Global Influenza Programme (GIP) Global action Plan (GAP) advisory group (AG), Geneva, Switzeland.
21. Le Van Hiep (2007), Up-date of the influenza vaccine production in IVAC Vietnam. GAP meeting, Bangkok, Thailand.
22. Nicole Lurie et al (2009), H1N1 influenzạ Public Health Preparedness and Health care reform, England jouARNl of medicine, Pages 843 - 845.
23. NVI-WHO (2009), Egg-base influenza vaccine manufacturing. Course manual Part 1+2, Bilthoven, the Netherlands.
24. Otfried Kistner, Keith Howard, Martin Spruth et al (2007), Cell culture (Vero) divired WHOle virus (H5N1) vaccine base on wild-type virus strain induces cross-protective immune response, Vaccine, Pages 6028 - 6036.
TÀI LIỆU INTERNET
25. http://www.cdc.gov/ncidod/EID/vol12no01/05-1147.html 26. http://www.cidrap.umn.edu/cidrap/conten/influenza/panflụhtml. 27. http://en.wikipediạorg/wiki/Influenza. 28. http://www.lif.se/Media/Vaccininfo/Bilagor/0060501_Influenza_Prototype_Ra ndD.pdf 29. http://www2ạcdc.gov/ncidod/ts/print.asp
PHỤ LỤC
Phụ lục 1 PHA HểA CHẤT
1. Pha dung dịch PBS 7,2
* Cụng thức pha PBS 7,2 trong một lớt dung dịch. - NaCl: 9g. - Na2HPO4.2H2O: 1,37g. - NaH2PO4.2H2O: 0,362g. - Nước cất 2 lần: 1 lớt. - Hấp vụ trựng 1210C/60 phỳt. * Pha chế
- Đong nước cất cho vào tăng đến khoảng ắ thể tớch cần pha, khuấy từ 300 – 350 vũng/phỳt.
- Cõn húa chất: Cõn lần lượt cỏc húa chất vào cốc cú mỏ.
- Hũa tan cỏc húa chất trờn theo thứ tự cho vào tăng chứa sẵn nước cất, trỏng lại bằng nước cất.
- Khuấy khoảng 30 phỳt
- Đo pH dung dịch: Lấy 10 ml đo pH - Lọc trong dung dịch PBS 7,2.
2. Pha dung dịch Natri-Citrat 0,125 M
* Cụng thức pha chế Natri-Citrat 0,125 M
- C6H5Na3O7.2H2O: 36,76 g - Nước cất 2 lần: 1 lớt - Hấp vụ trựng 1210C/ 30 phỳt
* Pha chế
- Đong nước cất cho vào tăng khoảng ắ thể tớch cần pha, khuấy từ 300 – 350 vũng/phỳt .
- Hũa tan Natri-citrat cho vào tăng chứa sẵn nước cất. - Khuấy từ khoảng 30 phỳt.
- Lọc trong dung dịch Natri-citrat 0,125 M.
3. Cồn 700
Pha chế 1 lớt cồn 700
- Đong 729 ml cồn 96% trong ống đong 1L. - Bổ sung 271ml nước cất.
- Cho vào chai để sử dụng, dung dịch này cú thể sử dụng nếu khồn bị đục hay bị tủa, sử dụng khụng quỏ 7 ngàỵ
Phụ lục 2 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA HÀM LƯỢNG FORMALIN TỒN DƯ * Nguyờn tắc:
Định lượng formalin bằng cỏch đo cường độ màu của 3,5 diacetyl.1,4 dihydrothydin ở bước súng 410 nm. Phức hợp tạo thành cú màu vàng chanh do phản ứng của formalin tự do trong mẫu vưới acetylaceton và amoni trong mụi trường acid nhẹ. Xỏc định hàm lượng formalin bằng phương phỏp đo quang với thuốc thử acetyl acetonẹ Theo tiờu chuẩn Việt Nam 905 – 1992 và TCYTTG thỡ hàm lượng formalin tồn dư cho phộp trong vacxin là ≤ 0,02%.
* Tiến hành:
- Ly tõm mẫu thử ở 3000 vũng/ phỳt, trong 5 phỳt.
- Hỳt 1ml dung dịch mẫu thử cho vào ống nghiệm (làm song song 2 ống cho một mẫu kiểm tra).
- Xõy dựng đường chuẩn: Cho vào cỏc ống nghiệm 0 ; 1; 2; 3; 4; 5 lần lượt 0; 0,4; 0,8; 1,2; 1,6; 2,0 ml dung dịch chuẩn formadehyd 2 àg/ ml.
Hàm lượng formaldehyd trong mỗi ống tương ứng là: 0; 0,8; 1,6; 2,4; 3,2; 4,0 àg/ ml.
- Thờm nước cất vừa đủ 2ml vào mỗi ống nghiệm.
- Thờm 2ml dung dịch acetylaceton ( pH = 6) vào mỗi ống nghiệm. - Đun cỏch thủy ở 370C trong 50 phỳt, dung dịch cú màu vàng chanh. - Lấy ra để nguội đến nhiệt độ phũng.
- Đo quang phổ ở bước song 410 nm.
* Kết quả:
Dựng đường chuẩn, dựa vào đường chuẩn để tớnh nồng đụ formalin trong
mẫu kiểm tra . Formalin (g%) = A * 100/1.000.000 a: số àg formalin của mẫu tớnh theo đường chuẩn.
100: tớnh theo tỷ lệ phần trăm. 1.000.000: đổi đơn vị từ àg sang g.
PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA HÀM LƯỢNG OVALBUMIN * Nguyờn tắc
Hàm lượng ovalbumin được xỏc định bằng phản ứng ELISA giỏn tiếp. Phương phỏp này dựa trờn sự kết hợp đặc hiệu giữa khỏng thể yhor khỏng ovalbumin với ovalbimin cú trong vacxin cỳm.
* Phương phỏp
- Phủ phiến ELISA bằng khỏng thể khỏng ovalbumin, để qua đờm ở 370C.
- Khúa phiến bằng dung dịch khúa phiến, sau đú được ủ với ovalbumin trong 1 giờ ở 370C.
- Khỏng thể đơn dũng khỏng ovalbumin được thờm vào, ủ 1 giờ ở 370C.
- Khỏng thể khỏng IgG chuột gắn biotin được dựng để phỏt hiện màu với cơ chất TMB.
- Đo mật độ quang của phiến ELISA ở bước song 450 nm.
- Tớnh toỏn kết quả bằng phần mềm KinetiCalc V2.03.
PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA HÀM LƯỢNG ENDOTOXIN * Nguyờn tắc
Hàm lượng enđotoxin được xỏc định bằng phương phỏp Limulus Ameobocyte Lysate (LAL).
Lysate là một hoạt chất được trớch ly từ mỏu của 1 loài sam biển (Horseshoe crab). Endotoxin làm hoạt hoỏ proenzyme thành enzyme (coagulase) cú trong lysatẹ Enzyme coagulase làm liờn kết protein coagulagen thành Coagulin. Khi cú sự hoạt hoỏ xảy ra với sự cú mặt của endotoxin sẽ làm lysate đụng tụ lại (gelation).
Coagulagen Endotoxin Proenzyme Coagulase Coagulin Coagulase
Phụ lục 3 Bảng P.1 Kết quả khảo sỏt hiệu giỏ HA của cỏc nhúm nhiệt độ trong cỏc
khoảng thời gian khỏc nhau ở lụ VXC/H1-1.2 HAU/ml Nhúm Giờ 2 - 80C 20 - 240C 36 - 380C 0 20480 20480 20480 6 5120 5120 5120 12 5120 5120 5120 24 5120 5120 5120 48 5120 5120 2560 72 5120 5120 1280 96 5120 5120 960 120 5120 2560 640
Bảng P.2 Kết quả khảo sỏt hiệu giỏ HA của cỏc nhúm nhiệt độ trong cỏc khoảng thời gian khỏc nhau ở lụ VXC/H1-2.2
HAU/ml Nhúm Giờ 2 - 80C 20 - 240C 36 - 380C 0 20480 20480 20480 6 5120 5120 5120 12 5120 5120 5120 24 5120 5120 5120 48 5120 5120 1920 72 5120 5120 1280 96 5120 5120 960 120 2560 2560 640
Bảng P.3 Kết quả khảo sỏt hiệu giỏ HA của cỏc nhúm nhiệt độ trong cỏc khoảng thời gian khỏc nhau ở lụ VXC/H1-3.2
HAU/ml Nhúm Giờ 2 - 80C 20 - 240C 36 - 380C 0 10240 10240 10240 6 2560 2560 2560 12 2560 2560 2560 24 2560 2560 2560 48 2560 2560 1280 72 2560 2560 960 96 2560 2560 640 120 1280 1280 480
Bảng P.4 Kết quả phản ứng HA kiểm tra hiệu lực bất hoạt của 3 lụ sản xuất
1 2 3 4 5 6 7 8 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 - - - - Lụ 1 - - - - Chứng õm - - - - Lụ 2 - - - - - - - - Mẫu 1 Lụ 3 - - - - - - - - Lụ 1 - - - - - - - + + Lụ 2 - - - + + - - - + + Mẫu 2 Lụ 3 - - - + + - - - + + Lụ 1 - - - + + - - - - Lụ 2 - - - - - - - - Mẫu 3 Lụ 3 - - - - Chứng dương - Lụ 1: lụ VXC/H1-1.2; Lụ 2: lụ VXC/H1-2.2; Lụ 3: lụ VXC/H1-3.2. - Mẫu 1: 2 - 80C; Mẫu 2: 20 - 240C; Mẫu 3: 36 - 380C.
- Kết quả õm tớnh: - - Kết quả dương tớnh: +
Bảng P.5 Kết quả khảo sỏt HA, SRID, RIV và EID50 của lụ số VXC/H1-01 ở cỏc thời gian khỏc nhau trong quy trỡnh bất hoạt
Test Giờ HA (HAU/ml) SRID (ààààg/ml) EID50 (EID50/ml) RIV 0 20480 243,7 6,72 NA 6 5120 121,54 0 NA 12 5120 221,3 0 NA 24 5120 221,12 NA NA 48 5120 221,04 NA Đạt 72 5120 220,94 NA Đạt 96 5120 220,83 NA Đạt
Bảng P.6 Kết quả khảo sỏt HA, SRID, RIV và EID50 của lụ số VXC/H1-02 ở cỏc thời gian khỏc nhau trong quy trỡnh bất hoạt
Test Giờ HA (HAU/ml) SRID (ààààg/ml) EID50 (EID50/ml) RIV 0 20480 237 6,89 NA 6 5120 210,56 0 NA 12 5120 210,32 0 NA 24 5120 210,17 NA NA 48 5120 210,09 NA Đạt 72 5120 210,03 NA Đạt 96 5120 210 NA Đạt
Bảng P.7 Kết quả khảo sỏt HA, SRID, RIV và EID50 của lụ số VXC/H1-03 ở cỏc thời gian khỏc nhau trong quy trỡnh bất hoạt
Test Giờ HA (HAU/ml) SRID (ààààg/ml) EID50 RIV 0 20480 245,7 6,54 NA 6 5120 212,6 0 NA 12 5120 212,3 0 NA 24 5120 211,98 NA NA 48 5120 211,74 NA Đạt 72 5120 211,43 NA Đạt 96 5120 211,25 NA Đạt