Hỡnh 1.4 Sơ đồ quy trỡnh bất hoạt virus cỳm A/H1N1/09
(theo quy trỡnh bất hoạt hiện tại của IVAC)
Để mở rộng sản xuất vacxin trờn quy mụ lớn thỡ việc phỏt triển quy trỡnh bất hoạt sao cho phự hợp là vụ cựng quan trọng, nhằm đảm bảo an toàn cho người sử dụng, rỳt ngắn thời gian và tăng hiệu quả sản xuất.
Bất hoạt bằng formalin Lọc sau bất hoạt Ủ ở nhiệt độ phũng Ly giải đường Cho dung dịch đệm Khuấy từ Khuấy từ Dịch virus Lọc trước bất hoạt
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIấN CỨU
2.1.1. Vật liệu
- Trứng gà sạch cú phụi 11 ngày tuổi do trại chăn nuụi Suối Dầu cung cấp. - Chủng virus NYMC X-179A tỏi tổ hợp cú nguồn gốc từ chủng A/Califonia/7/2009, mó số 09/124, do Viện NIBSC (Vương quốc Anh) cung cấp.
2.1.2. Dung dịch khỏng nguyờn virus
Dung dịch khỏng nguyờn virus trước bất hoạt được sản xuất theo quy trỡnh của IVAC bao gồm 3 lụ liờn tiếp:
- Lụ VXC/H1-1: Hiệu giỏ HA trước bất hoạt là 20480 HAU/ml. - Lụ VXC/H1-2: Hiệu giỏ HA trước bất hoạt là 20480 HAU/ml. - Lụ VXC/H1-3: Hiệu giỏ HA trước bất hoạt là 10240 HAU/ml.
2.1.3. Thiết bị
- Tủ ấm 350C (hóng JEIO TECH/ Hàn Quốc). - Tủ lạnh 2 - 80C (hóng ACSON/ Hàn Quốc). - Mỏy lắc (IKA).
- Tủ cấy an toàn sinh học cấp 2 (ESCO). - Mỏy khuấy từ (IKA).
- Laminar (IVAC).
- Bơm nhu động (THERMO).
2.1.4. Dụng cụ và húa chất - Đầu cụn 200 àl, 1000 àl. - Đầu cụn 200 àl, 1000 àl. - Syringe nhựa 0,5 ml, 1 ml. - Multichannel 12 kờnh/8 kờnh. - Pipet 10 ml. - Pipetman 50 – 1000 àl.
- Đốn soi trứng. - Dựi trứng inox. - Bộ panh kộo cong. - Phiến chữ Ụ
- Formalin 37% (MERCK).
- Dung dịch Natri Citrate 0,125M (MERCK). - Cồn 700 (Việt Nam).
- Dung dịch NaHSO3 35% (MERCK). - Dung dịch PBS 7,2.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
Test Test Test Test Hỡnh 2.1 Sơ đồ bố trớ thớ nghiệm HA Dịch virus sau siờu ly tõm Nghiờn cứu nồng độ formalin bất hoạt Khảo sỏt tớnh hiệu quả và ổn định Quy trỡnh bất hoạt Xõy dựng quy trỡnh bất hoạt Khảo sỏt tớnh an toàn Nghiờn cứu nhiệt độ và thời gian bất hoạt
HA SRID RIV RIV EID50 SRID RIV EID50 HA SRID Formalin tồn dư Ovalbumin Endotoxin
2.2.1. Một số phương phỏp kiểm định (test)
2.2.1.1. Phương phỏp xỏc định hiệu giỏ HA (HAU) [23] ạ Nguyờn lý ạ Nguyờn lý
Khỏng nguyờn haemaglutinin của virus cỳm cú khả năng ngưng kết hồng cầu của động vật mỏu núng. Phản ứng này giỳp xỏc định được sự cú mặt của khỏng nguyờn HA trong mẫu thử.
b. Thực hiện
- Pha loóng mẫu 1/10.
- Cho 50 àl PBS + 0,5% BSA vào tất cả cỏc giếng của phiến. - Cho mẫu đó pha loóng vào phiến chữ Ụ
- Cho chứng õm (-): dung dịch PBS. - Cho chứng dương (+): dịch chủng virus. - Pha loóng bậc 2 trờn phiến chữ Ụ
- Thờm 50 àl hồng cầu gà 1% vào tất cả cỏc giếng của phiến.
- Lắc nhẹ sau đú để yờn phiến trong nhiệt độ phũng từ 30 phỳt đến 4 giờ.
c. Đọc kết quả
- Phản ứng dương tớnh: Hồng cầu bị ngưng kết dưới đỏy giếng và khụng bị chảy hồng cầu khi nghiờng phiến.
- Phản ứng õm tớnh: Hồng cầu bị lắng xuống thành chấm nhỏ ở đỏy giếng và bị chảy hồng cầu khi nghiờng phiến.
- Hiệu giỏ HA được tớnh ở độ pha loóng cao nhất cũn cho phản ứng dương tớnh. Đơn vị HAU được tớnh bằng đảo ngược của hiệu giỏ HẠ
Bảng 2.1 Phản ứng ngưng kết hồng cầu trờn phiến 96 giếng
Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Chứng
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1/10 A 1/20 B 1/40 C 1/80 D (-) 1/160 E 1/320 F 1/640 G 1/1280 H (+) Dương tớnh: Âm tớnh:
2.2.1.2. Phương phỏp xỏc định hiệu lực bất hoạt (RIV) [23] ạ Nguyờn lý ạ Nguyờn lý
Xỏc định hiệu lực bất hoạt là kiểm tra chắc chắn khụng cũn virus cỳm hoạt động sau khi đó bất hoạt.
Mẫu thử được tiờm cho cỏc nhúm trứng gà cú phụị Kết quả đạt yờu cầu nếu sau hai lần cấy chuyền trứng sống trờn 80% và dịch niệu cú phản ứng HA õm tớnh.
b. Tiến hành
* Chuẩn bị trứng
- 10 trứng cho mỗi độ pha loóng mẫụ - 5 trứng cho chứng dương.
- 5 trứng cho chứng õm.
- Khử trựng trứng bằng cồn 700.
- Soi đỏng dấu buồng khớ và vị trớ tiờm, đục lỗ tại vị trớ tiờm.
* Chuẩn bị mẫu
- Mẫu được trung hũa formalin tồn dư bằng NaHSO3 (NaHSO3 được pha loóng với PBS tỷ lệ 1: 8). 3 ml mẫu + 30 àl NaHSO3/30 phỳt ở nhiệt độ phũng.
- Pha loóng mẫu trong dung dịch PBS theo bậc 10 từ dộ pha loóng 10-1 - 10-10.
* Tiờm trứng
- Mẫu: Mỗi độ pha, tiờm 0,2 ml/trứng, thực hiện tiờm 10 trứng. - Chứng õm (-): Tiờm 0,1 ml PBS/ trứng, thực hiện 5 trứng.
- Chứng dương (+): Tiờm 0,1 ml chủng virus/trứng, thực hiện 5 trứng. - Ủ trứng trong tủ ủ ở 350C /72 giờ /độ ẩm 65 - 70%.
- Ủ lạnh: Đặt toàn bộ trứng sống vào tủ lạnh 2 - 80C/12 giờ để giết phụị - Thu gặt 0,5 ml dịch niệu của mỗi quả trứng sống, hộn lại và thực hiện tiờm truyền lần haị
Thực hiện tiờm truyền lần hai như lần một nhưng thay mẫu bằng dịch niệu của trứng. Sau quỏ trỡnh ủ thỡ thu hoạch dịch niệu của trứng cũn sống để làm phản ứng HẠ
2.2.1.3. Phương phỏp kiểm tra hàm lượng HA (phản ứng SRID) [23]ạ Nguyờn lý ạ Nguyờn lý
Hàm lượng khỏng nguyờn HA được xỏc định bằng phản ứng miễn dịch khuyếch tỏn vũng đơn (SRID). Phản ứng dựa vào sự kết hợp đặc hiệu giữa khỏng thể khỏng HA với khỏng nguyờn HA trong vacxin tạo nờn vũng ngưng kết.
b. Tiến hành
- Pha huyết thanh chuẩn khỏng HA trong agarose 1%.
- Đổ trờn phiến kớnh 120 mm x 120 mm, để thạch nguội, đục cỏc giếng trờn thạch đường kớnh 4 mm/giếng.
- Khỏng nguyờn chuẩn và mẫu thử được xử lý với Zwittergent 10% trong 30 phỳt, theo tỷ lệ 1/10.
- Cho vào cỏc giếng 20àl mẫu thử hoặc khỏng nguyờn chuẩn, đặt vào buồng ấm ở 250C trong 48 - 72 giờ.
- Nhuộm màu bằng dung dịch xanh Comassie 0,3% trong 1 giờ.
- So sỏnh đường kớnh vũng ngưng kết với đường kớnh của khỏng nguyờn chuẩn.
2.2.1.4. Phương phỏp xỏc định liều gõy nhiễm trờn trứng gà cú phụi (EID50) [23] ạ Nguyờn lý ạ Nguyờn lý
Virus cú khả năng sống và nhõn lờn trong dịch niệu của trứng gà cú phụi và dương tớnh với phản ứng ngưng kết hồng cầụ Liều gõy nhiễm EID50 là chỉ số quan trọng xỏc định khả năng nhõn lờn của virus trong trứng. Dựa vào đú, người ta xỏc định được nồng độ tối ưu để virus nhõn lờn tốt nhất trong trứng.
b. Thực hiện
* Chuẩn bị trứng
- 10 trứng cho mỗi độ pha loóng mẫụ - 5 trứng cho chứng dương.
- 5 trứng cho chứng õm.
- Khử trựng trứng bằng cồn 700.
- Soi đỏng dấu buồng khớ và vị trớ tiờm, đục lỗ tại vị trớ tiờm.
* Pha loóng mẫu
Pha loóng mẫu trong dung dịch PBS theo bậc 10 từ dộ pha loóng 10-1 - 10-10.
* Tiờm trứng
- Mẫu: Mỗi độ pha tiờm 0,1 ml/trứng, thực hiện 10 trứng. - Chứng õm (-): Tiờm 0,1 ml PBS/ trứng, thực hiện 5 trứng.
- Chứng dương (+): Tiờm 0,1 ml chủng virus/trứng, thực hiện 5 trứng. - Ủ trứng trong tủ ủ ở 350C /72 giờ /độ ẩm 65 - 70%.
- Ủ lạnh: Đặt toàn bộ trứng sống vào tủ lạnh 2 - 80C/12 giờ.
- Thu hoạch dịch niệu từ mỗi trứng riờng rẽ và xỏc định khả năng nhõn lờn của virus trong mỗi trứng bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA).
* Tớnh kết quả
Cụng thức Reed & Muench:
F X B F X LogA
EID log log log
log 50 = + 1 = + 2 , , , 1 50 B A A X − − = và , , , 2 50 B A B X − − = - A: Số mũ nồng độ cú HA dương tớnh cận trờn 50%. - B: Số mũ nồng độ cú HA dương tớnh cận dưới 50%. - A’: Tỷ lệ phần trăm cận trờn 50%. - B’: Tỷ lệ phần trăm cận dưới 50%.
2.2.2. Phương phỏp lấy mẫu sau bất hoạt
- Chuẩn bị tube vụ trựng, đỏnh dấu số mẫu, số lụ. - Pha loóng dung dịch NaHSO3 1/8.
- Tiến hành: Mỗi mẫu lấy 2,97 ml mẫu + 30 àl dung dịch NaHSO3 1/8. - Bảo quản: 2 - 80C.
2.2.3. Phương phỏp nghiờn cứu chọn nồng độ formalin thớch hợp
- Nồng độ formalin bất hoạt cú ảnh hưởng trực tiếp tới hiệu quả bất hoạt và khỏng nguyờn của virus. Vỡ vậy, cần tiến hành xỏc định nồng độ formalin bất hoạt thớch hợp nhằm đạt hiệu quả bất hoạt tốt nhất và khụng ảnh hưởng tới khỏng nguyờn của virus. Đề xỏc định nồng độ formalin bất hoạt, tiến hành bất hoạt 3 lụ thử nhiệm liờn tiếp ở 3 nồng độ formalin khỏc nhau là 0,01%; 0,02%; 0,04%.
- Tiến hành bất hoạt virus ở nhiệt độ 20 - 240C/96 giờ. Sau 96 giờ lấy mẫu ở cỏc nhúm kiểm tra hiệu lực bất hoạt (RIV), hiệu giỏ HA (HA) và hàm lượng HA (SRID) nhằm khảo sỏt sự thay đổi về khỏng nguyờn của virus trước và sau quỏ trỡnh bất hoạt. So sỏnh cỏc chỉ số trờn của cỏc nhúm để chọn lựa nồng độ formalin thớch hợp.
Lụ VXC/H1-1.1(300 ml)
Kiểm tra HA, SRID 100 ml 100 ml 100 ml VXC/H1-1.1B VXC/H1-1.1B VXC/H1-1.1C (formalin 0,01%) (formalin 0,02%) (formalin 0,04%)
Sau 96 giờ bất hoạt Lấy mẫu – Test
HA SRID RIV
Chọn nồng độ formalin thớch hợp
Hỡnh 2.2 Sơ đồ bố trớ thớ nghiệm xỏc định nồng độ formalin
Bố trớ thớ nghiệm tương tự ở 2 lụ tiếp theo: Lụ VXC/H1-2.1, lụ VXC/H1-3.1.
2.2.4. Phương phỏp nghiờn cứu chọn nhiệt độ và thời gian bất hoạt
- Sau khi lựa chọn được nồng độ formalin bất hoạt thớch hợp, chỳng tụi tiến hành nghiờn cứu nhiệt độ và thời gian bất hoạt.
- Nhúm nhiệt độ nghiờn cứu: 2 - 80C, 20 - 240C, 36 - 380C.
- Thực hiện 3 lụ thử nghiệm liờn tiếp tương ứng: VXC/H1-1.2, VXC/H1-2.2 và VXC/H1-3.2.
Tiến hành lấy mẫu song song ở 3 nhúm theo cỏc khoảng thời gian sau: 0, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 giờ (h) để kiểm tra cỏc test RIV, HA, SRID.
So sỏnh cỏc chỉ số kiểm tra của cỏc nhúm bất hoạt để từ đú lựa chọn được nhiệt độ và thời gian bất hoạt thớch hợp.
Lụ VXC/H1-1.2(300 ml) Dung dịch formalin 100 ml 100 ml 100 ml VXC/H1-2.1A VXC/H-2.2B VXC/H1-2.3C (2 - 80C) (20 - 240C) (36 - 380C) Lấy mẫu 0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
Kiểm tra ( Test)
SRID EID50 RIV HA
Chọn lựa nhiệt độ và thời gian thớch hợp
Hỡnh 2.3 Sơ đồ bố trớ thớ nghiệm xỏc định nhiệt độ và thời gian bất hoạt
Thực hiện kiểm tra hiệu giỏ HA (test SRID) ở cỏc khoảng thời gian 0, 6, 96 giờ để khảo sỏt sự thay đổi hàm lượng khỏng nguyờn virus.
Kiểm tra hiệu lực bất hoạt (test RIV) sau 120 giờ. Liều gõy nhiễm virus trờn trứng gà cú phụi (test EID50) thực hiện ở 0, 1, 4, 6 giờ. Kiểm tra hiệu giỏ HA ở tất cả cỏc khoảng thời gian trờn.
2.2.5. Xõy dựng quy trỡnh bất hoạt
Việc xõy dựng quy trỡnh bất hoạt virus cỳm A/H1N1 dựa trờn cơ sở lý luận về đặc tớnh húa lý của formalin, đặc điểm sinh học của khỏng nguyờn và kết quả nghiờn cứu của 3 lụ sản xuất theo quy trỡnh bất hoạt mớị
Tiến hành bất hoạt 3 lụ liờn tiếp VXC/H1-01, VXC/H1-02, VXC/H1-03 theo cỏc thụng số về nồng độ formalin, nhiệt độ và thời gian bất hoạt đó ngiờn cứu được để khảo sỏt tớnh an toàn, hiệu quả và ổn định của quy trỡnh bất hoạt mớị
Thực hiện khảo sỏt hiệu giỏ HA, hàm lượng HA (SRID), hiệu lực bất hoạt (RIV) và liều gõy nhiễm virus trờn trứng gà cú phụi (EID50) để xỏc định tớnh hiệu quả và ổn định. Khảo sỏt hàm lượng formalin tồn dư, endotoxin và ovalbumin để xỏc định tớnh an toàn của quy trỡnh bất hoạt mớị
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả khảo sỏt nồng độ formalin bất hoạt
Nồng độ formalin bất hoạt ảnh hưởng trực tiếp tới hiệu quả, tớnh an toàn của vacxin cỳm. Để nghiờn cứu quy trỡnh bất hoạt virus thỡ việc xỏc định nồng độ formalin bất hoạt là rất quan trọng. Chỳng tụi tiến hành bất hoạt dung dịch khỏng nguyờn virus ở 20 - 240C/96 giờ với 3 nồng độ formalin khỏc nhau là: 0,01%, 0,02%, 0,04%. Để khảo sỏt sự thay đổi của khỏng nguyờn virus, cỏc thụng số hiệu giỏ khỏng nguyờn (HA), hàm lượng khỏng nguyờn (SRID) và hiệu lực bất hoạt (RIV) được khảo sỏt ở thời điểm trước và sau bất hoạt với cỏc nồng độ formalin khỏc nhaụ
Kết quả được thể hiện ở cỏc bảng 3.1, 3.2, 3.3.
Bảng 3.1 Kết quả khảo sỏt HA của 3 lụ thử nghiệm HAU/ml Nhúm Lụ Formalin 0,01% Formalin 0,02% Formalin 0,04% Trước bất hoạt 20480 20480 20480 VXC/H1-1.1 Sau bất hoạt 3840 5120 640 Trước bất hoạt 20480 20480 20480 VXC/H1-2.1 Sau bất hoạt 3840 5120 640 Trước bất hoạt 10240 10240 10240 VXC/H1-3.1 Sau bất hoạt 2560 2560 480
Qua kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, trong cựng một điều kiện bất hoạt (nhiệt độ, thời gian và tốc độ khuấy đảo) thỡ:
- Nhúm nồng độ formalin 0,01% cú hiệu giỏ HA trước và sau bất hoạt giảm tương đương nhau ở cả 3 lụ (20480 - 3840 HAU/ml và 10240 – 2560 HAU/ml).
- Nhúm nồng độ formalin 0,02% cú hiệu giỏ HA sau bất hoạt giảm ớt hơn so với 2 nhúm cũn lại (20480 - 5120 HAU/ml và 10240 – 2560 HAU/ml)
- Ở nhúm bất hoạt formalin 0,04% thỡ hiệu giỏ HA giảm tương đương nhau ở 3 lụ, song hiệu giỏ HA sau bất hoạt lại giảm rất nhiều so với nhúm formalin 0,01% và 0,02%, chứng tỏ nồng độ formalin càng cao cú thể ảnh hưởng tới khỏng nguyờn HA của virus.
Bảng 3.2 Kết quả khảo sỏt RIV của 3 lụ thử nghiệm Nhúm Test Formalin 0,01% Formalin 0,02% Formalin 0,04% Trước bất hoạt Khụng đạt Khụng đạt Khụng đạt VXC/H1-1.1 Sau bất hoạt Đạt Đạt Đạt Trước bất hoạt Khụng đạt Khụng đạt Khụng đạt VXC/H1-2.1 Sau bất hoạt Đạt Đạt Đạt Trước bất hoạt Khụng đạt Khụng đạt Khụng đạt VXC/H1-3.1 Sau bất hoạt Đạt Đạt Đạt
Sau 3 lụ sản xuất thử nghiệm, ở cả 3 nhúm nồng độ formalin 0,01%, 0,02% và 0,04% kết quả kiểm tra hiệu lực bất hoạt đều đạt sau quỏ trỡnh bất hoạt. Điều này chứng tỏ, virus đó được bất hoạt hoàn toàn.
Bảng 3.3 Kết quả khảo sỏt SRID của 3 lụ thử nghiệm
à à à àg/ml Nhúm Lụ Formalin 0,01% Formalin 0,02% Formalin 0,04% Trước bất hoạt 246,07 246,07 246,07 Sau bất hoạt 196,86 ± 0,06 221,46 ± 0,03 147,6 ± 0,04 VXC/H1-1.1 Hiệu suất 80% 90% 60% Trước bất hoạt 243,8 243,8 243,8 Sau bất hoạt 197,5 ± 0,078 212,1 ± 0,06 163,3 ± 0,046 VXC/H1-2.1 Hiệu suất 81% 87% 67% Trước bất hoạt 236,54 236,54 236,54 Sau bất hoạt 189,23 ± 0,02 210,52 ± 0,021 158,48 ± 0,02 VXC/H1-3.1 Hiệu suất 80% 89% 67%
Hiệu suất trung bỡnh 80% 88% 64%
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% H iệ u s u ấ t S R ID ( % )
Formalin 0,01% Formalin 0,02% Formalin 0,04%
Kết quả ở bảng 3.3và hỡnh 3.1 cho thấy:
- Sau 3 lụ bất hoạt, hàm lượng HA của nhúm formalin 0,02% giảm trung bỡnh