Nghiên cứu ứng dụng quy trình công nghệ sản xuất văcxin bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin

BKHCN-BYT TTKHSXVXSB BKHCN-BYT TTKHSXVXSB BKHCN-BYT TTKHSXVXSB Bé Khoa häc c«ng nghệ y tế Trung tâm KHSX Văcxin Sabin 135 Lò đúc Hà nội Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật Đề tài Nghiên cứu ứng dụng quy trình công nghệ sản xuất Văcxin Bại liệt bÊt ho¹t tõ chđng Sabin M· sè : KC.10-24 GS.TSKH Nguyễn Văn Mẫn 5857 05/6/2006 Hà nội 12/2005 Bản quyền 2005 thuộc TTKHSXVXSB Đơn xin chép toàn phần tài liệu phải gửi đến Giám ®èc TTKHSXVXSB trõ tr−êng hỵp sư dơng víi mơc ®Ých nghiên cứu Bộ Khoa học công nghệ y tế Trung tâm KHSX văcxin Sabin 135 Lò đúc Hà nội Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài Nghiên cứu ứng dụng quy trình công nghệ sản xuất Văcxin Bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin Mà số : KC.10-24 GS.TSKH Nguyễn Văn Mẫn Hà nội 12/2005 Bản thảo viết xong 11/2005 Tài liệu đợc chuẩn bị sở kết thực Đề tài cấp Nhà nớc, mà số KC.10-24 Đề tàI nghiên cứu khoa học công nghệ nhà nớc KC10-24 Nghiên cứu ứng dụng quy trình công nghệ sản xuất Văcxin Bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin Cố vấn Khoa học: GS.TSKH Hoàng Thủy Nguyên Chủ nhiệm đề tài : GS.TSKH Nguyễn Văn Mẫn Các cán tham gia: TS Nguyễn Thị Quỳ TS Nguyễn Đăng Hiền PGS.TS Lê Thị Luân Ths Cao Xuân Thịnh Cn Đặng Mai Dung Cn Dơng Thị Nga Cn Ngun Thanh Thủ Cn Ngun H¶i Thanh Cơ quan thực hiện: Trung tâm Khoa học Sản xuất Văcxin Sabin Chữ viết tắt bảng kí hiệu chữ viết tắt ARN Axít Ribonucleic ATCC American Type Correction Centre BH BÊt ho¹t BSA Bovin Serum Albumin BT Bào thai CCID50 Cell culture infective dose (liều gây nhiễm 50% nuôi tế bào) CDC Dd Dung dịch DMEM Dubeco Minimum Essencial Medium Du Antigen-D unit (đơn vị kháng nguyên D) ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch ĐƯKT Đáp ứng kháng thÓ EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Hep2C Human Laryngocacinoma cincinati (tế bào ung th quản ngời) HIV Human HRP Horseradish peroxidase HVĐT Hiển vi điện tử IgG Immuno globulin G (globulin miƠn dÞch G) IgM Immuno globulin M (globulin miƠn dÞch M) IgA Immuno globulin A (globulin miƠn dÞch A) IPV Inactivated Polio Vaccine (Văcxin Bại liệt bất hoạt-Văcxin Bại liệt chết) IPVK Văcxin bại liệt bất hoạt sản xuất từ tế bào thận khỉ IPVkBT Văcxin bại liệt bất hoạt sản xuất từ tế bào thận khỉ bào thai IPVV Văcxin bại liệt bất hoạt sản xuất từ tÕ bµo Vero JEM JVKT Japan Verver Kidney Tissue kDa Kilo Dalton KHT Kháng huyết KHVĐT Kính hiển vi ®iƯn tư KTT KhØ tr−ëng thµnh LHE Lactabumin Hydrolysate Eagle (trong đệm Hanks) Chữ viết tắt LH3E Lactabumin Hydrolysate Eagle (trong đệm Earle) LMC Liệt mềm cấp M0 Trớc tiêm liỊu M1 Sau tiªm liỊu M2 Sau tiªm liều M3 Sau tiêm liều M199 Môi trờng 199 MEF MEM Minimum Essencial Medium MGCB MWCB Master Working Cell Bank (Ngân hàng tế bào giống) MWCO OPV Oral Polio Vaccine (Vắc xin Bại liệt uống) P0 Tế bào tiên phát P1 Tế bào tiên phát tách lần P2 Tế bào tiên phát tách lần PARKER Môi tr−êng 199 PB Phosphate Buffer PBF PJRI Polio Japan Research Institute POLIOVAC Trung tâm Khoa học Sản xuất Văcxin Sabin PVDF Polyvinyl-idene-difluoride RD TÕ bµo ung th− phỉi ë ng−êi SIV Simian Immunodeficieny Virus (Virut gây suy giảm miễn dịch khØ) S-IPV Sabin - Inactivated Polio Vaccine SL Siªu läc SLT Siêu ly tâm SSL Sau siêu lọc SV40 Simian virus 40 TB Tế bào TBH Trớc bất hoạt TBS 1X Tris-HCl buffed solution lần TCMR Tiêm chủng mở rộng Chữ viết tắt TCTQ Tiêm chủng toàn quốc TCYTTG Tỉ chøc Y tÕ ThÕ giíi TKTF TÕ bµo thËn khỉ tiên phát TTKHSXVXSB Trung tâm KHSX văcxin Sabin TSL Tr−íc siªu läc VERO The kidney cells of an African Green Monkey (Tế bào thận khỉ xanh châu phi) VLDT VËt liƯu di trun VRBL Virót B¹i liƯt WHO World Health Organization (Tỉ chøc Y tÕ ThÕ giíi) Mơc lơc Mục lục Trang Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Mục lục Đặt vấn đề Ch−¬ng : Tỉng quan 1.1 Virut B¹i liƯt 1.1.1 Phân loại virut 1.1.2 Hình thái học 1.1.3 Thành phần hoá học virut Bại liệt 1.1.4 TÝnh chÊt miƠn dÞch häc 1.1.5 Sù nh©n lên virut bại liệt tế bào cảm thụ 1.2 T×nh hình Bại liệt Việt nam 1.3 Văcxin phòng bệnh Bại liệt 1.3.1 LÞch sư văcxin Bại liệt 1.3.2 S¶n xuÊt văcxin Bại liệt bất hoạt 1.3.3 Khả bảo vệ văcxin IPV 10 1.3.3.1 So sánh loại văcxin OPV IPV 11 1.3.3.2 Thanh toán Bại liệt ViÖt nam 12 1.3.3.3 Vấn đề sử dụng văcxin sau đà toán Bại liệt 12 1.3.3.4 Vấn đề nghiên cứu sản xuất văcxin Bại liệt bất hoạt Nhật 13 1.3.3.5 ViƯc sư dơng IPV vµ OPV ë Mü 14 1.4 Chiến lợc sử dụng văcxin IPV thÕ giíi – liỊu dïng khun c¸o 15 Chơng : Vật liệu phơng pháp nghiên cøu 18 2.1 Vật liệu nghiên cứu sản xuất 18 2.1.1 Chñng virut 18 2.1.2 TÕ bµo 18 2.1.2.1 TÕ bào thận khỉ tiên phát thứ phát 18 2.1.2.2 TÕ bµo th−êng trùc Vero 19 2.1.3 Các loại môi tr−êng 20 2.1.4 G©y nhiƠm virut 20 2.1.5 Quá trình cô đặc tinh chế kháng nguyên 21 2.1.5.1 Quá trình cô đặc tinh chế kháng nguyªn b»ng siªu läc 21 2.1.5.2 Quá trình cô đặc tinh chế kháng nguyên siêu ly tâm 22 2.1.5.3 Tinh chÕ 23 2.1.5.4 Kiểm tra văcxin tinh chế qua giai đoạn 24 2.1.6 BÊt ho¹t virut týp 1, týp vµ 25 Môc lục 2.1.7 Pha văcxin 25 2.1.8 Sơ đồ tóm tắt 26 2.2 Vật liệu phơng pháp kiểm tra chất lợng văcxin B¹i liƯt bÊt ho¹t tõ chđng Sabin 28 2.2.1 Đối tợng nghiên cứu 28 2.2.1.1 Văcxin Bại liệt bất hoạt bán thành phẩm 28 2.2.1.2 Văcxin Bại liệt bất hoạt thành phẩm 28 2.2.2 VËt liƯu vµ dơng cô 28 2.2.3 Phơng pháp nghiên cứu 30 2.2.3.1 Khỉ số liệu tế bào Vero dïng cho s¶n xuÊt 30 2.2.3.2 Xác định hiệu giá văcxin đơn giá qua giai đoạn sản xuất 30 2.2.3.3 Xác định týp virut văcxin đơn týp thử nghiệm nhận dạng 31 2.2.3.4 Kiểm tra an toàn đặc hiệu văcxin đơn týp súc vật thử nghiệm 32 2.2.3.5 Xác định quy trình bất hoạt virut Bại liệt 33 2.2.3.6 Kiểm tra protein đặc hiệu virut Bại liệt 33 2.2.3.7 Ph−¬ng pháp tính đơn vị kháng nguyên D 36 2.2.3.8 KiÓm tra tÝnh vô trùng văcxin đơn giá văcxin thành phẩm 37 2.2.3.9 Xác định hàm lợng Formaldehyde/liều văcxin BTP TP 37 2.2.3.10 Xác định hàm lợng protein/liều văcxin BTP TP 38 2.2.3.11 KiÓm tra đáp ứng miễn dịch khỉ 39 Ch−¬ng : KÕt bàn luận 42 3.1 X©y dùng quy trình công nghệ sản xuất vắc xin bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin 42 3.1.1 Tách tế bào thận khỉ trởng thành phơng pháp truyền dịch trypsin - versen .42 3.1.2 Nuôi tế bào thËn khØ vµ Vero 43 3.1.3 G©y nhiƠm virut 44 3.1.4 Cô đặc hỗn dịch văcxin đơn type siêu lọc 49 3.1.5 Cô đặc tinh chế kháng nguyên siêu ly tâm 52 3.1.6 Tinh chÕ 55 3.1.7 Bất hoạt kháng nguyên 60 3.1.8 Pha văcxin thành phẩm 63 3.2 KÕt qu¶ kiểm tra chất lợng văcxin bại liệt bất hoạt từ chđng Sabin 64 3.2.1KiĨm tra khỉ số liệu tế bào Vero dùng cho s¶n xuÊt IPV 64 3.2.1.1 KiĨm tra khØ tr−íc dïng cho s¶n xt 64 3.2.1.2 NhËt ký tế bào vero dùng cho sản xuất 64 3.2.1.3 NhËn xÐt 64 3.2.2 HiƯu gi¸ cđa văcxin đơn týp qua giai đoạn sản xuất 64 3.2.3 Xác định týp văcxin đơn týp thử nghiệm nhận dạng 67 3.2.4 Kiểm tra an toàn đặc hiệu văcxin đơn týp súc vật thử nghiệm 68 3.2.5 KiĨm tra ®é sèng cđa virut trớc trình bất hoạt 68 Mục lục 3.2.6 Protein đặc hiệu virut B¹i liƯt 70 3.2.7 Tính vô trùng văcxin đơn giá văcxin thành phẩm 72 3.2.8 Kết đáp ứng miễn dịch trªn khØ 73 3.2.9 Hàm lợng Formaldehyde văcxin thành phÈm 81 3.2.10 Hµm lợng protein văcxin thành phẩm 82 Ch−¬ng : KÕt luËn đề nghị 83 4.1 Xây dựng công nghệ sản xuất văcxin Bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin 83 4.2 Xây dựng quy trình kiểm định văcxin Bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin 84 4.3 Xây dựng công thức pha văcxin Bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin 85 4.4 Xây dựng tiêu chuẩn chất lợng cho văcxin bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin 85 4.5 KÕt qu¶ 86 Tài liệu tham khảo 88 Phô lôc Mục lục Danh mục bảng báo cáo Trang Bảng : Tỷ lệ trẻ tuổi mắc bại liên quan đến số liều văcxin tiêm 10 Bảng : Kháng thể trung hoà đợc tạo trẻ em tình nguyện có phản ứng d huyết âm tính đợc tiêm phßng 14 Bảng : Công thức pha dung dÞch Formaldehyde chuÈn 38 Bảng : Pha loÃng mẫu thử 10 lần 38 Bảng : Môi trờng sinh trởng môi trờng trì loại tế bào 43 Bảng : Hiệu giá 13 loạt văcxin bại liệt typ sản xuất TB thận KTT 44 Bảng : Hiệu giá 18 loạt văcxin bại liệt typ sản xuất TB thận khỉ bào thai 44 Bảng : Hiệu giá loạt văcxin bại liệt typ sản xuất tế bào Vero 45 Bảng : Hiệu giá 13 loạt văcxin bại liệt typ sản xuất TB thận KTT 46 Bảng 10 : Hiệu giá 12 loạt văcxin bại liệt typ sản xuất TB thận khỉ bào thai 46 Bảng 11 : Hiệu giá 11 loạt văcxin bại liệt typ sản xuất tế bào Vero 47 Bảng 12 : Hiệu giá loạt văcxin bại liệt typ sản xuất TB thận KTT 47 Bảng 13 : Hiệu giá loạt văcxin bại liệt typ sản xuất TB thận khỉ bào thai 48 Bảng 14 : Hiệu giá 11 loạt văcxin bại liệt typ sản xuất tế bào Vero 48 B¶ng 15 : HiƯu giá văcxin bại liệt typ 1, 2, sản xuất loại tế bào 48 Bảng 16 : Hiệu giá văcxin typ sau siªu läc 50 Bảng 17 : Hiệu giá văcxin typ sau siªu läc 50 Bảng 18 : Hiệu giá văcxin typ sau siªu läc 51 Bảng 19 : Hiệu giá văcxin typ sau siêu ly tâm 52 B¶ng 20 : HiƯu giá văcxin typ sau siêu ly tâm 53 B¶ng 21 : Hiệu giá văcxin typ sau siêu ly tâm 54 Bảng 22 : Hiệu giá typ loại tế bào qua bớc tiến hành 56 Bảng 23 : Hàm lợng protein toàn phần qua công đoạn so với thể tích cô đặc 57 Bảng 24 : Hiệu giá, số lợng ®Õn s¶n phÈm ci cïng cđa typ 1, typ typ 61 Bảng 25 : Kiểm tra khỉ cho sản xuất IPV typ 64 B¶ng 26 : Lô tế bào Vero dùng cho sản xuất 64 B¶ng 27 : Hiệu giá văcxin bán thành phẩm typ tế bào thận khỉ tiên phát Vero 65 Bảng 28 : Hiệu giá văcxin bán thành phẩm typ tế bào thận khỉ tiên phát Vero 66 Bảng 29 : Hiệu giá văcxin bán thành phẩm typ tế bào thận khỉ tiên phát Vero 67 Bảng 30 : Kết ®Þnh typ virut 68 B¶ng 31 : KÕt kiểm tra an toàn đặc hiệu động vật nhá 68 B¶ng 32 : Kết kiểm tra độ sống virut typ trớc trình bất hoạt 69 Bảng 33 : Kết kiểm tra độ sống virut typ trớc trình bất hoạt 69 Bảng 34 : Kết kiểm tra độ sống virut typ trớc trình bất hoạt 70 Tài liệu tham khảo replication in humans Virology, 1981, 108:405-423 93 Oduntan S.O., Lucas A.O., Wennen E.M (1978) The immunologic response of Nigerian infants to attenuated and inactivated poliovaccines Ann Trop Med Parasitol 1978, 72: 111-115 94 Ogra PL, Karzon DT, Righthand F, Mac Gillivrany M (1968) Immunoglobulin response in serum and secretions after immunization with live and inactivated poliovaccine and natural infection N Engl J Med 1968;279:893-900 95 Omata T., Kohara M., Kuge S., Komatsu T (1986) Genetic analysis of the attenuation phenotyp of poliovirus typ J Virol 1986; 58: 348-358 96 Orga.P.L., Karzon.D.T.(1971) Formation and function of poliovirus antibody in different tissues Progres in medical virology, 1971,13: 156-193 97 Orga.P.L., Karzon.D.T., Righthand F, Macgillivrany M (1968) Immunoglobulin response in serum and secretions after immunization with live and inactivated poliovaccine and natural infection.N Engl J Med 1968; 279:893900 98 Paul J.R., Melnick J.L., Barnett W.H., Goldblum H.A A survey of neutralizing antibodies to poliomyelitis in Cairo Egypt Amer J Hyg, 55: 402-413 99 Peetermans J.(1996) Factors affecting the stability of viral vaccines.Dev Biol Stand Basel, Karger, 1996 Vol 87: 97-101 100 Pollard SR, Dunn G, Cammack N et al (1989) Nucleotide sequence of a neurovirulent variant of the typ oral poliovirus vaccine J Virol 1989; 63: 4949-4951 100 Tài liệu tham khảo 101 Rasmussen CM, Thomas CW, Mulrooney RJ, Morrissey RA: (1973) Inadequate poliovirus immunity levels in immunized Illinois children Am J Dis Child 1973; 126: 465-469 102 Ren R and V.R Racaniello (1992) Human poliovirus receptor gene expression and poliovirus tissue tropism in transgenic mice J.Virol 1992, 66:296-304 103 Ren R., F Costantini, E.J Gorgacz, J.J Lee and V.R Racaniello.(1990) Transgenic mice expressing a human poliovirus receptor: a new model for poliomyelitis Cell, 1990, 63:296-304 104 Researcher's Associates The National Institute Of Health (1996) Vaccine handbook Maruzen-Tokyo, 1996 105 Rezapkin GV, Chumakov KM, Lu Z et al.(1994) Microevaluation of Sabin strain in vivo and genetic stability of oral poliovirus vaccine Virology 1994; 202: 370-378 106 Rueckert R.R (1985) Picornaviruses and their replication In: Fields(ed) ,Virology Nee York, 1985, 705-738 107 Sabin A.B and Boulger L.R.(1973) History of Sabin attenuated poliovirus oral live vaccine strains J Biol Stand 1:115-118 108 Sabin A.B (1993) Reflections on the quanlitative and quantitative aspects of neurovirulence of different polioviruses Dev Biol Stand 1993;78:3-7 109 Sabin AB, Hennessen WA, Winsser J:(1954) Studies on variants of poliomyelitis virus: I Experimental segregation and properties of avirulent variants of three immunologic typs 101 Tài liệu tham khảo J Exp Med 1954;99:551-576 110 Sabin AB: (1957) Properties and behavior of orally administered attenuated poliovirus vaccine JAMA 1957;164:1216-1223 111 Sabin AB:(1986) Poliomyelitis In Braude AI, David CE, Fierer J (eds): International Textbook of Medicine , ed Philadelphia, WB Saunders, 1986, vol 2, Infectious Diseases and Medical Microbiology 112 Salk D: (1980) Eradication of poliomyelitis in the United States Rev Infect Dis 1980;2:243-257 113 Salk J, Bennett BL, Lewis LJ, Ward EN, Youngner JS: (1953) Studies in human subjects on active immunization against poliomyelitis: I A preliminary report of experiment in progress JAMA 1953; 151: 1081-1098 114 Salk J, Gori JB: (1960) A review of theoretical, experimental and practical considerations in the use of formaldehyde for the inactivation of poliovirus Ann NY Acad Sci 1960;83:609-637 115 Salk J, Stoeckel Ph, Van Wezel A, et al, (1982) Antigen content of inactivated poliovirus vaccine for use in a one or two dose regimen Ann Clin Res 1982;14:204-212 116 Salk J et al (1981) Theroretical and pratical considerations in the application od killed poliovirus vaccine for the control of paralytic poliomyelitis Dev Biol Srand 1981; 47:181-198 117 Salk J.(1984) One-dose immunization against paralytic poliomyelitis using a noninfectious vaccine Rev Infect Dis 1984; 6:444-450 118 Salk J:(1955) Vaccination against paralytic poliomyelitis Performance and prospects 102 Tài liệu tham khảo Am J Public Health 1955; 45:575-596 119 Salk J:(1960) Persistance of immunity after administration of poliovirus vaccine Lancet 1960; : 715-723 120 Sangar D., Pipkin P.A., Wood D.J., Minor P.D.(1999) Examination of Poliovirus vaccine preparations for SV40 Sequences Biologycals, 1999, 27, 1-10 121 Shall S (1973) Sedimentation in sucrose and ficoll gradients of Cells grown in suspension culture Tissue culture methods and applications 1973, 198-204 122 Smith WM, Chambers VC, Evans CA:(1950) Growth of neurotropic viruses in extraneural tissues; preliminary report on the propagation of poliomyelitis virus ( Lansing and Hof strains) in cultures of human testicular tissue NW Med 1950; 49: 368-373 123 Stanley J Cryz, Jr (1991) Vaccines and Immuotherapy McGraw-Hill,Inc 1991 124 Stones P.B., MacDon;d C.R., McDougallJ.K et al (1964) Preparation and properties of a derivative of Sabin's typ poliovirus strain Leon 12a,b 10th Symposium of the European Association against poliomyelitis Warsaw 390397 125 Taffs RE, Chumakov M, Rezapkin GV et al.(1995) Genetic stability and mutant selection of Sabin strain of oral poliovirus vaccine grown under different cell culture conditions Virology 1995; 209: 366-373 126 Thomas D.Brock, David W.Smith, Michael T.Madigan Biology of Microorganisms Fourth Edition.Viruses.10: 316-349 127 Toyoda H, Kohara M, Kataoka Y et al.(1984) Complete nucleotide sequence of all three poliovirus serotyps 103 Tµi liƯu tham kh¶o J Mol Biol 1984; 174: 561-585 128 Tissue culture methods and applications.(1973) Trypsin Academic Press1973, 5-8 129 Tissue culture methods and applications (1973) Trypsin Academic Press, 1973, 8-12 130 Van Wezel A:(1967) Growth of cell strains and primary cells on microcarriers in homogeneous culture Nature 1967;216:64-65 131 Ward C.D., Stoekes M.A., Flanegan J.B (1988) Direct measurement of the poliovirus RNA polymerase error frequency in vitro J Virol 62:558-562 132 Wawtt H.V (1992) Incubation of poliomyelitis as canculated from the time of entry into the central nervous system via the peripheral netve pathways Rev.Infect.Dis 1992, 165:444-449 133 Westrop GD, Evans DMA, Dunn G et al Genetic basis of attenuation of the Sabin Typ oral poliovaccine J Virol 1989; 63: 1338-1344 134 White D.O., Fennev F.(1994) Picornaviridae MedicalVirology, 1994,: 381-391 135 WHO Consultative Group on Poliomyelitis vaccines (1985): Report to World Health Organization , 1985 136 WHO Consultative Group (1982) The relation between acute persisting spinal paralysis and poliomyelitis vaccine result of ten year enquiry Bull WHO 1982;60:231-242 137 WHO (1990) 104 Tài liệu tham khảo Manual for the virological investigation of Poliomyelitis 1990 ,WHO/EPI/CDS/POLIO/90.1 138 WHO (1992) Expended program on Immunization Poliomyelitis in 1988,1989 and 1990 Wkly.Epidem.Rec.,1992,67:113-120 139 Wood D.J and Macadam A.J (1997) Laboratory tests for Live attenuated Poliovirus Vaccine Biological 25:3-15 140 World Health Organization (1990) Requirements for poliomyelitis vaccine (oral) Technical report series 1990; 800:30-86 141 World Health Organizition/ Regional office for the western pacific (1996) REPORT- Sixth meeting of the Technical Advisory Group on EPI and Poliomyelitis Eradication in the Western Pacific region 142 Yang C.F., De L., Holloway B.P., Pallansch M.A., Kew O.M (1991) Detection and identification of vaccine-related polioviruses polymerase chain reaction Virus Res 1991,20: 159-179 143 Youngner J.S (1954) Proc.Soc.Exp.Biol.Med 1954, 85:202 105 Phụ lục Phụ lục 1-A Qui trình sản xuất kiểm định văcxin bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin Sản xuất kiểm định Khỉ ngân hàng tế bào thờng trực (vero) Kiểm tra nguyên liệu đầu vào : Theo tiêu chuẩn TCYTTG áp dụng cho văcxin OPV Tách tế bào thận khỉ lÊy -→ KiĨm tra tÕ bµo nuôi : tế bào từ nitơ lỏng ra: với 7.104tế bào/ ml- 170ml/ 1chai Roux(250cm2) Nuôi tế bào thận khỉ cấy truyền tế bào vero : tế bào líp 34 triƯu tÕ bµo/ Roux(250cm2) -→ Gây nhiễm bại liệt chủng Sabin với liều gây nhiƠm 1CCID50/300 tÕ bµo → Theo tiªu chn cđa TCYTTG ¸p dơng cho OPV KiĨm tra b¸n thành phẩm : Theo tiêu chuẩn TCYTTG áp dụng cho OPV Tạo bán thành phẩm Cô đặc hỗn dịch bán thành phẩm siêu lọc(UF) màng 100.000 dalton Kiểm tra bán thành phẩm sau siêu lọc : Hiệu giá; vô trùng theo qui trình Viện Bại liệt Nhật Bản(PJRI) Cô đặc siêu ly t©m (Ucfg)36.000v /4giê/ 60C -→ Kiểm tra bán thành phẩm sau siêu ly tâm : Hiệu giá; độ tinh sạch; vô trùng : theo qui trình Viện Bại liệt Nhật Bản Tinh cột trao đổi ion Kiểm tra bán thành phẩm sau tinh chế : Hiệu giá; độ tinh sạch; vô trùng ( DEAE sepharose CL-6B) -→ Lọc trớc bất hoạt (0,22àm) Bất hoạt formalin tû lƯ 1:4000, ë 370C,12 ngµy → Lọc bất hoạt ngày thứ (0,22àm) Hén typ tõ typ 1; typ 2; typ Trung hoà formalin(đơn typ) sau 12 ngày bất hoạt dung dịch Sodium bisulfit 8,8% 0,005ml/ml Thêm chất bảo quản 2-Phenoxy ethanol Kiểm tra bán thành phẩm sau bất hoạt : Kiểm tra kháng nguyên D; Độ sống tồn d bại liệt; Hàm lợng formaldehyt tồn d; Protein toàn phần; protein đặc hiệu :Theo qui trình Nhật Bản Phụ lục 0,5% Văcxin thành phẩm( sản phẩm cuối cùng)Chia liỊu(®ãng èng) -→ KiĨm tra vô trùng Định lợng kháng nguyên D Kiểm tra yếu tố gây sốt Kiểm tra hàm lợng Protein toàn phần Kiểm tra hàm lợng formaldehyt Kiểm tra pH Kiểm tra an toàn chung Kiểm tra tính gây miễm dịch khỉ Kiểm tra 2- Phenoxy ethanol Theo qui trình Nhật Bản Báo cáo tóm tắt Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng quy trình công nghệ sản xuất văcxin bại liệt bất hoạt từ chủng sabin Mục tiêu đề tài: 1.1 Sản xuất đợc văcxin bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin tế bào thận khỉ tế bào Vero 1.2 Đánh giá tính an toàn hiệu lực văcxin phòng thí nghiệm theo tiêu chuẩn Việt Nam tiêu chuẩn TCYTTG Nội dung nghiên cứu đề tài (theo hợp đồng): 2.1 Lựa chọn tế bào dùng cho sản xuất văcxin: Từ hai nguồn tế bào thận khỉ tiên phát tế bào thờng trực Vero 2.2 Lựa chọn môi trờng tách nuôi tế bào 2.3 Gây nhiễm virut bại liệt từ chủng Sabin giảm độc: Chđng Sabin typ ViƯn Søc kh Qc gia NhËt B¶n cung cÊp cã ký hiƯu: Typ 1: WHO – IS – 90C Typ 2: IIS – 90A Typ 3: IIIS 79A 2.4 Lựa chọn môi trờng gây nhiễm virut 2.5 Thu sản phẩm thô typ riêng rẽ 2.6 Cô đặc văcxin đơn typ siêu lọc 2.7 Cô đặc tiếp siêu ly tâm 2.8 Tinh chế kháng nguyên virut 2.9 Bất hoạt virut: Đa đợc nồng độ formaldehyde dùng cho bất hoạt thời gian bất hoạt 2.10 Hộn văcxin đơn giá 2.11 Tính liều pha hộn ba typ để tạo vacxin thành phẩm 2.12 Kiểm định: - Kiểm tra khỉ trớc sản xuất - Kiểm tra tác nhân ngoại lai tÕ bµo (thËn khØ vµ Vero) - KiĨm tra sau gây nhiễm văcxin bại liệt (Vô trùng, hiệu giá, nhận dạng, an toàn virut, an toàn động vật, độc lực thần kinh khỉ) - Kiểm tra trớc siêu lọc - Kiểm tra trớc siêu ly tâm - Kiểm tra sau siêu ly tâm - Kiểm tra ®é tinh khiÕt cđa virut - KiĨm tra tr−íc bÊt hoạt - Kiểm tra sau bất hoạt - Định lợng D-antigen typ riêng rẽ để tính liều pha văcxin thành phẩm - Kiểm tra vô trùng - Kiểm tra văcxin thành phẩm: độc tố, miễn dịch, protein, phenoxyethanol - Đánh giá sản phẩm đợc tạo từ hai loại tế bào Thận khỉ tiên phát Vero để xác định hớng sản xuất văcxin Các kết đạt đợc: 3.1 Lựa chọn môi trờng sinh trởng môi trờng trì loại tế bào hiệu suất tế bào đôi thận khỉ: T T Loại tế bào ThËn khØ bµo thai ThËn khØ tr−ëngthµnh TÕ bµo th−êng Trực (vero) Số chai roux / cặp thận 20 Môi trờng phát triển Eagle M199 +10% FBS 120 LHE + 10% BCS cÊy truyÒn 1→ - DMEM M199 + 10% FBS Môi trờng trì Eagle M199 LH3E M199 3.2 Hiệu giá trung bình virut bại liệt typ loại tế bào: TT Typ Hiệu giá tế bào Hiệu giá tế bào Hiệu giá tế bào TKTT (LgCCID50/ml) TKBT(LgCCID50/ml) Vero(LgCCID50/ml) Typ 8,069 ± 0,208 8,165 ± 0,223 8,23 ± 0,267 Typ 7,6 ± 0,397 7,89 ± 0,158 7,44 ± 0,332 Typ 8,18 ± 0,151 7,87 0,195 8,31 0,246 Kết bảng cho thấy hiệu giá virut bại liệt chủng Sabin gây nhiễm loại tế bào typ nh sau: - Typ loại tế bào cao không chênh nhiều (0,1 đến 0,16) - Typ 3: hiệu giá virut tÕ bµo thËn khØ tr−ëng thµnh vµ tÕ bµo Vero cao không khác biệt nhiều, nhiên hiệu giá tế bào thận khỉ bào thai lại thấp so với hai loại tế bào - Typ 2: Có hiệu giá thấp typ typ nhng typ loại tế bào cho kết không khác biệt nhiều (0,39-0,45) nằm giới hạn cho phép (có ý nghĩa thống kê) 3.3 Hiệu giá ba typ tế bào qua bớc tiến hành cô đặc văcxin nh sau: TT Typ Hiệu giá trớc siêu lọc lgCCID50/ml HG sau siêu ly tâm lgCCID50/ml Tăng 18,6-19,9 l Typ1 Hiệu giá sau Siêu lọc lgCCID50/ml Giảm 1,1-1,2 l Trên TBTK 8,18 ± 0,28 9,45 ± 0,17 9,40 ± 0,17 Trªn TBvero 8,14 ± 0,07 9,44 ± 0,23 9,44 ± 0,15 Tăng 7,6-11,7 l Tăng 2-1,1 l Typ2 Trên TBTK 8,00 ± 0,32 8,88 ± 0,25 9,18 ± 0,25 Trªn TBVero 7,91 ± 0,27 8,98 ± 0,27 9,11 ±0,19 Tăng 26,9-15,5 l Tăng 1,1 lần Typ3 Trên TBTK 8,02 ± 0,37 9,5 ± 0,4 9,53 ± 0,39 Trªn TBVero 8,14 ± 0,45 9,33 ±0,13 9,37 ±0,13 KÕt qu¶ bảng cho thấy sau siêu lọc siêu ly tâm hiệu giá virut tăng lên đáng kể, nhiên virut bớc tiến hành không tránh khỏi (điều phù hợp với nghiên cứu Nhật Bản) Kết đà khẳng định hiệu giá virut bại liệt gây nhiễm tế bào thận khỉ tế bào Vero nh - Đề tài ®· sư dơng gel DEAE sepharose CL-6B ®Ĩ tinh chÕ virut đạt đợc độ tinh khiết cao: hình ảnh kính hiển vi điện tử hình ảnh điện di, kiểm tra hàm lợng protein mức cho phép không chứa protein tạp - Đề tài đà bất hoạt 33 loạt kháng nguyên đơn typ dung dÞch formalin 36% víi tû lƯ 1:4000, ë 370C bể điều nhiệt 12 ngày, lọc sau ngày bất hoạt Trung hoà formalin tồn d sodium bisulfit (NaHSO3) sau bất hoạt Đề tài đà kiểm tra đợc sau 12 ngày bất hoạt virut sống tồn d hoàn toàn không Đề tài đà thu đợc sản phẩm nh mục tiêu đề Sản phẩm thu đợc qua trình sản xuất tế bào thận khỉ tế bào vero đà đợc kiểm tra an toàn hiệu lực nh mục tiêu đà đề theo bảng dới Tên thử nghiệm Typ Typ Typ So víi T.C cđa WHO KiĨm tra công hiệu Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Tơng tự Thử nghiệm nhận dạng Polio typ Polio typ Polio typ T−¬ng tù KiĨm tra vô khuẩn Vô khuẩn Vô khuẩn Vô khuẩn Tơng tự Kiểm tra an toàn chung Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Tơng tự Hàm lợng protein toàn phần (mcg/liều) 50 50 (Dợcđiển VN 2000) 50 (Dợcđiển VN 2000) Theo tiêu chuẩn Việt Nam (Dợcđiển VN 2000) Hàm lợng Formaldehyde tồn d (g%) 0,012 (dợcđiển VN 2000) 0,012 (dợcđiển VN 2000) 0,012 (dợcđiển VN 2000) Theo tiêu chuẩn Việt Nam pH 7,1 – 7,3 7,1 – 7,3 7,1 – 7,3 T−¬ng tự Kết luận Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Đạt yêu cầu Kiểm tra đáp ứng miễn dịch khỉ đề tài đà dùng 50 khỉ thử nghiệm văcxin tam liên theo nồng độ kháng nguyên D Nhật Bản mức so sánh với mẫu chuẩn văcxin Imovac Pasteur Merier - Pháp : Nồng độ : Typ : 30 Đơn vị kháng nguyên D Typ 2: 30 Đơn vị kháng nguyên D Typ 3: 50 Đơn vị kháng nguyên D Nồng độ : Typ : Đơn vị kháng nguyên D Typ 2: 100 Đơn vị kháng nguyên D Typ 3: 100 Đơn vị kháng nguyên D Đà có kết đáp ứng miễn dịch 80% nồng độ lấy tiêu chuẩn để pha văcxin tam liên cho sở Nh vậy, với mục tiêu đề theo hợp đồng ký Trung Tâm KHSXVX Sabin với Ban Chủ nhiệm KC.10, đề tài đà đạt đợc đầy đủ mục tiêu đề mục tiêu cha đạt đợc Kết đợc đa vào bảng sau: TT I Yêu cầu kỹ thuật, tiêu chất lợng sản phẩm tạo Dự Mức chất lợng Đ kiến Mẫu tơng tự Tên sản phẩm tiêu sản Đơn vị đo sản chất lợng chủ yếu Cần đạt Trong Nhật xuất phẩm nớc Bản (ml) Qui trình công nghệ sản xuất văcxin bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin qui mô phòng thí nghiệm Hỗn dịch văcxin sống giảm ®éc lùc typ - An CCID50/ml 1000 49,5lÝt >108/ml Cha có 109 toàn theo WHO Hỗn dịch văcxin sống giảm độc lực typ An CCID50/ml toàn theo WHO Hỗn dịch văcxin sống giảm độc lực typ An CCID50/ml toàn theo WHO Virut văcxin bất hoạt typ An toµn theo WHO Du/ml 109 1000 41,2lÝt >108/ml Ch−a cã 109 1000 45,6lÝt 25-80 Ch−a cã 25-80 10 990 ml 25-80 Ch−a cã 25-80 10 725 ml Virut văcxin bất hoạt typ An toàn theo WHO Du/ml Cha có Virut văcxin bất hoạt typ An toµn theo WHO Du/ml >108/ml 25-80 Ch−a cã 25-80 10 880 ml 5000 liÒu 5600 liÒu Văcxin bất hoạt tam liên An toàn theo WHO II III IV Đơn vị kháng nguyên D/ liều theo Nhật Bản Typ1 typ : 30Du Typ3: 50Du Typ typ2: 30Du Typ 3: 50Du 5000 liều văcxin bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin đạt tiêu chuẩn Việt Nam Đà đăng báo đăng vào tháng 3/2006 Đà đào tạo đợc thạc sĩ Cha có Kết luận: Đề tài đà đa ra: 4.1 Quy trình công nghệ sản xuất văcxin bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin 4.2 Quy trình kiểm tra chất lợng, an toàn hiệu lực văcxin bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin 4.3 Xây dựng công thức pha văcxin bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin Văcxin (s-IPV) bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin sản xuất POLIOVAC pha theo công thức Nhật Bản gồm typ : * Typ : đơn vị kháng nguyên D * Typ : 100 đơn vị kháng nguyên D * Typ : đơn vị kháng nguyên D Với đệm pha loÃng M199 ion Mg2+, Ca2+, Po42+ đỏ phenol , với chÊt b¶o qu¶n 2-phenoxy ethanol : 0,5% ; pH= 7,1-7,3 4.4 Xây dựng tiêu chuẩn Việt Nam cho Văcxin Bại liệt bất hoạt từ chủng SaBin 4.4.1 Vô trùng theo tiêu chuẩn WHO 4.4.2 An toàn theo tiêu chuẩn WHO 4.4.3 Hàm lợng kháng nguyên theo tiêu chuẩn Nhật Bản - Typ : đơn vị kháng nguyên D - Typ : 100 đơn vị kháng nguyên D - Typ : 100 đơn vị kháng nguyên D 4.4.5 Hàm lợng Protein 50àg/liều theo tiêu chuẩn Việt Nam (Dợc điển VN 2000) 4.4.6 Hàm lợng formaldehyt tồn d 0, 012% theo tiêu chuẩn Việt Nam (Dợc ®iÓn VN 2000) 4.4.7 pH = 7,1 - 7,3 Trung tâm đ sản xuất đợc 5000 liều văcxin bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin nh đ đăng ký đề tài Những đóng góp đề tài: - Đây văcxin bất hoạt từ chủng Sabin giảm độc lực lần đợc sản xuất Trung tâm KHSX văcxin Sabin - Dựa trang thiết bị có sản xuất văcxin bại liệt uống (OPV) số trang thiết bị đại nh siêu lọc, siêu ly tâm, tinh chế - Những yêu cầu, tiêu chuẩn WHO đòi hỏi với văcxin đợc bảo đảm tối thiểu - Trung tâm nghiên cứu sản xuất thử loại tế bào có u Việt Nam (nguyên liệu tế bào thận khỉ) công nghệ tế bào khác (tế bào Vero) để sẵn sàng triển khai yêu cầu 6.1 Về giải pháp Khoa học Công nghệ - Nghiên cứu sản xuất văcxin mang tính Khoa học Công nghệ cao, tiếp cận đợc với phơng pháp đợc sử dụng nớc tiên tiến giới - Trung tâm đợc dự án tăng cờng lực trang thiết bị nghiên cứu khoa học Bộ Y tế đà có đợc số máy móc nh siêu lọc, siêu ly tâm 6.2 Về phơng pháp nghiên cứu - Trung tâm đà đợc Viện Polio Nhật Bản giúp đỡ kinh nghiệm tiến hành nghiên cứu phù hợp với yêu cầu WHO - Trung tâm đà nghiên cứu thực qui trình sản xuất văcxin bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin điều kiện Việt Nam 6.3 Những đóng góp khác Về xà hội: - Văcxin IPV phải thay văcxin OPV giới việc nghiên cứu văcxin IPV cần thiết để trẻ em Việt Nam đợc phòng bệnh bại liệt văcxin Việt Nam sản xuất - Tiếp tục giữ vững đợc thành toán bệnh bại liệt mục tiêu bảo vệ lâu dài cho trẻ em Về khoa học: - Kết đề tài đà khẳng định sản xuất đợc văcxin bại liệt từ chủng Sabin không cần phải nhập ngoại - Văcxin Việt Nam sản xuất trang thiết bị đại đạt đợc tiêu chuẩn WHO tiến tới việc phối hợp văcxin bại liệt bất hoạt với văcxin khác nh DPT, viêm gan - Về trình độ kiến thức, kinh nghiệm sản xuất văcxin IPV cán Trung tâm đợc nâng lên để thực đợc nhiều đề tài nghiên cứu khoa học khác - Kết hợp nghiên cứu đào tạo sau đại học: thạc sĩ báo Đề nghị - Với kết trên, đề nghị Hội đồng, Bộ KHCN, Bộ Y tế tạo điều kiện để đợc tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện qui trình sản xuất văcxin bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin qui mô nhỏ, tiến tới thử nghiệm ngời để sớm đa văcxin vào sử dụng cho trẻ em Việt Nam - Hiện Trung tâm KHSX Văcxin Sabin ®· cã mét sè m¸y mãc tèi thiĨu ®đ ®Ĩ sản xuất qui mô nhỏ Xin trân trọng cám ơn! ... (Văcxin Bại liệt bất hoạt -Văcxin Bại liệt chết) IPVK Văcxin bại liệt bất hoạt sản xuất từ tế bào thận khỉ IPVkBT Văcxin bại liệt bất hoạt sản xuất từ tế bào thận khỉ bào thai IPVV Văcxin bại liệt. .. 2.2.1. 2Văcxin bại liệt bất hoạt thành phẩm Các loạt văcxin thành phẩm nghiên cứu ứng dụng qui trình công nghệ sản xuất văcxin bại liệt bất hoạt POLIOVAC - Văcxin bại liệt tam liên bất hoạt (gồm... trùng đóng lọ PH =7,1 7,3 Bảo quản từ 4-80C 2.1.8 Sơ đồ tóm tắt quy trình công nghệ sản xuất văcxin bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin nghiên cứu ứng dụng quy trình Nhật Bản Tế bào thận khỉ tiên