Tiếp theo sau quá trình siêu lọc, chúng tôi tiến hành quá trình siêu ly tâm văcxin cả 3 týp. Lần 1 : ở tốc độ36.000 vòng/phút/4giờ/60C lấy cặn bỏ n−ớc nổi (với tốc độ và thời gian nh− vậy virut sẽ lắng cặn) sau đó hoà cặn vào 10ml PB 0,1M lắc qua đêm, ngày hôm sau tách rời virut bằng siêu âm.
Lần 2 : tiếp tục ly tâm ở 15.000vòng/30 phút/60C, lấy n−ớc nổi, bỏ cặn.
Tr−ớc khi thực hiện các quy trình tiếp theo chúng tôi lấy mẫu, chuẩn độ hiệu giá để đánh giá kết quả thu đ−ợc.
Bảng 19 : Hiệu giá văcxin typ 1 sau siêu ly tâm
TT Loạt V văcxin
tr−ớc SLT
V văcxin sau SLT
Hiệu giá sau SLT LgCCID50/ml Hiệu giá tr−ớc BH LgCCID50/ml 1 IPVv/ 01/I 120 ml 50 ml 8,75 9,19 2 IPVv/ 02/I 120 ml 70 ml 9,19 9,20 3 IPVv/ 03/I 120 ml 50 ml 9,06 9,37 4 IPVv/ 04/I 100 ml 50 ml 9,09 9,06 5 IPV / 05/I 100 ml 50 ml 9,32 9,32
116 66 45 35 25 18,4 kDa TT Loạt V văcxin tr−ớc SLT V văcxin sau SLT
Hiệu giá sau SLT LgCCID50/ml
Hiệu giá tr−ớc BH LgCCID50/ml
6 IPVk/ 06/I 100 ml 55 ml 9,32 9,32 7 IPVv/ 07/I 100 ml 50 ml 9,37 9,43 8 IPVk/ 08/I 160 ml Dồn mẫu 11 9,31 9,31 9 IPVk/ 09/I 160 ml 60 ml 9,75 9,75 10 IPVk/ 10/I 170 ml Dồn mẫu11 9,37 9,37 11 IPVk/ 11/I 200 ml 100 ml 9,50 9,50 12 IPVk/ 12/I 200 ml 100 ml 9,56 9,25
ảnh 7 : điện di các loạt văcxin typ 1 sau siêu ly tâm
12 loạt văcxin týp 1 sau siêu ly tâm tiến hành lấy mẫu, chạy điện di trên gel polyacrylamide. Trên ảnh 7 chỉ ra rằng các loạt văcxin týp 1 sau siêu ly tâm vẫn còn rất nhiều “band” tạp của protein không đặc hiệu so với hình ảnh điện di của mẫu đã đ−ợc tinh chế, do vậy b−ớc tiếp theo cần phải tinh chế văcxin.
Bảng 20 : Hiệu giá văcxin typ 2 sau siêu ly tâm
TT Loạt V văcxin tr−ớc SLT V văcxin sau SLT HG sau SLT LgCCID50/ml HG tr−ớc BH LgCCID50/ml 1 IPVV/01/ II (L05) 300 ml 50 ml 8,68 8,86 2 IPVV/02/ II(L04) 250 ml 30 ml 9,06 9,06 3 IPVK/03/ II(L07) 250 ml 30 ml 8,87 8,87 4 IPVK/04/ II(L04) 200 ml 30 ml 8,81 9,25 5 IPVK/05/ II(L05) 300 ml 30 ml 8,80 9,31 6 IPVV/06/ II(9+11) 160 ml 60 ml 8,87 9,27 7 IPVK/08/ II 100 ml 90 ml 8,50 8,83 8 IPVK/09/ II 150 ml 100 ml 9,32 9,25 9 IPVK/10/ II 180 ml 100 ml 9,32 9,25 10 IPVK/11/ II 200 ml 100 ml 8,81 9,56 11 IPVK/12/ II 200 ml 100 ml 9,32 TC dồn 13 12 IPVK/13/ II 150 ml Dồn12 9,06 9,18 Mẫu đã tinh chế
kDa 116 66 45 35 25 18,4
Kết quả bảng 20 cho thấy sau siêu ly tâm 12 loạt văcxin týp 2 có đến 3 loạt hiệu giá bị giảm xuống, mặc dù thể tích văcxin đã đ−ợc cô đặc, nh− vậy quá trình siêu ly tâm một l−ợng virut văcxin đã bị thất thoát trong quá trình thực hiện.
ảnh 8 : điện di các loạt typ 2 sau siêu ly tâm
12 loạt văcxin týp 2 sau siêu ly tâm tiến hành lấy mẫu, chạy điện di trên gel polyacrylamide. Trên ảnh 8 chỉ ra rằng các loạt văcxin týp 2 sau siêu ly tâm cũng vẫn còn rất nhiều “band” tạp của protein không đặc hiệu so với hình ảnh điện di của mẫu đã đ−ợc tinh chế, do vậy b−ớc tiếp theo cần phải tinh chế văcxin.
Bảng 21 : Hiệu giá văcxin typ 3 sau siêu ly tâm
TT Loạt V tr−ớc SLT V sau SLT HG sau SL LgCCID50/ml HG tr−ớc BH LgCCID50/ml 1 IPVV/01/III 90 ml 60 ml 9,44 9,44 2 IPVk/02/III 100 ml 50 ml 8.94 8,94 3 IPVV/03/III 100 ml (l01) 9,44 9,44 4 IPVV/04/III 100 ml 50 ml 9,38 9,38 5 IPVk/05/III 140 ml 40 ml 9,19 9,19 6 IPVk/06/III 160 ml 55 ml 9,50 9,50 7 IPVk/07/III 150 ml 100 ml 10,5 9,87 8 IPVk/08/III 200 ml 100 ml 9,81 9,87 9 IPVk/09/III 200 ml 100 ml 9,50 9,81
116 66 45 35 25 18,4 ảnh 9 : điện di các loạt typ 3 sau siêu ly tâm
Quá trình siêu ly tâm đã loại bỏ bớt những protein tạp trong văcxin, nh−ng vẫn ch−a đủ để làm tinh sạch văcxin, trên ảnh 9 vẫn còn nhiều “band” của albumin tồn d− có trong văcxin.
Sau siêu ly tâm thể tích giảm xuống ít nhất là 1/2 (nhiều loạt phải giảm 1/5) nh−ng hiệu giá nhiều khi không đ−ợc nâng lên mà thậm chí lại giảm đi vì quá trình tiến hành qua các công đoạn bị mất virut.
ảnh 10 : tách rời virut sau siêu ly tâm 36.000 vòng/4 giờ/ 60C
ảnh 11 : Bỏ cặn sau siêu ly tâm 15.000 vòng/30 phút/60C
3.1.6 Tinh chế
Hỗn dịch thu đ−ợc sau siêu ly tâm sẽ lọc qua 0,22àm, sau đó cho chạy qua cột gel
DEAE Sepharose CL-6B đã nhồi sẵn. Lấy từng phân đoạn. Các phân đoạn đó lấy mẫu chạy điện di, phân đoạn sạch đem thử hiệu giá, đoạn nào sạch và hiệu giá cao hộn lại với nhau, thử hiệu giá để có giá trị tr−ớc bất hoạt nh− bảng 17, 18, 19 trên. Gel DEAE Sepharose CL-6B là 1
anion yếu. Trung tâm dùng cột R = 1-2 cm, dùng cho mỗi mẫu hết 200ml gel DEAE Sepharose CL 6B, tuy nhiên gel có thể xử lý dùng tái lại.
Qua các kết quả siêu lọc, siêu ly tâm, tinh chế kháng nguyên 33 loạt nghiên cứu chúng tôi đã đạt đ−ợc mục đích đề ra :
1. Đã cô đặc kháng nguyên từ 10 đến 57 lần bằng siêu lọc 2. Đã cô đặc kháng nguyên bằng siêu ly tâm từ 2 đến 10 lần 3. Hiệu giá kháng nguyên đ−ợc tăng lên phù hợp với sự cô đặc
Bảng 22 : Hiệu giá 3 typ trên các loại tế bào qua các b−ớc tiến hành
Typ HG tr−ớc SL lgCCID50/ml HG sau SL lgCCID50/ml HG sau SLT lgCCID50/ml
Typ 1 Tăng18,6 - 19,9 lần Giảm1,1 - 1,2 lần
Trên TBTK 8,18 ± 0,28 9,45 ± 0,17 9,40 ± 0,17 Trên tế bào vero 8,14 ± 0,07 9,44 ± 0,23 9,44 ± 0,15
Typ 2 Tăng 7,6 - 11,7 lần Tăng 1,1 - 2 lần
Trên TBTK 8,00 ± 0,32 8,88 ± 0,25 9,18 ± 0,25 Trên tế bào vero 7,91 ± 0,27 8,98 ± 0,27 9,11 ±0,19
Typ 3 Tăng 26,9 - 15,5 lần Tăng 1,1 lần
Trên TBTK 8,02 ± 0,37 9,5 ± 0,4 9,53 ± 0,39
Trên tế bào vero 8,14 ± 0,45 9,33 ±0,13 9,37 ±0,13 Việc bị mất virut trong quá trình tinh chế làm sạch virut ở các giai đoạn siêu lọc, siêu ly tâm lần 1 (virut mất đi qua n−ớc nổi loại bỏ), siêu ly tâm lần 2 (virut còn lẫn trong cặn bị loại bỏ) là không tránh khỏi, do vậy vấn đề đặt ra với nhóm nghiên cứu là phải cố gắng nâng hiệu giá văcxin đơn týp sản xuất trên các dòng tế bào để hiệu giá văcxin sau tinh chế đủ cao cho sản xuất văcxin thành phẩm, đồng thời cũng sẽ đảm bảo hiệu quả kinh tế.
Tuy nhiên sự mất virut trong quá trình siêu ly tâm là không tránh khỏi : Mặc dù đã cô đặc bằng giảm thể tích, nh−ng còn mất virut trong n−ớc nổi bị loại đi sau SLT 36.000v/4giờ/60C, sau đó lại mất virut ở quá trình siêu âm và cặn bỏ đi của giai đoạn ly tâm 15.000v/30 phút/60C.
Quá trình tinh chế kháng nguyên: Chúng tôi tính hàm l−ợng protein toàn phần của hỗn dịch đơn typ :
- Nếu hỗn dịch đ−ợc cô đặc bao nhiêu lần thì hàm l−ợng protein sẽ tăng lên bấy nhiêu lần nh−ng thực tế không phải nh− vậy một số protein tạp đã đ−ợc loại bằng siêu lọc (mảnh xác tế bào vỡ nhỏ, muối vô cơ, n−ớc, môi tr−ờng nuôi, 1 số thành phần trong huyết thanh) và l−ợng virut bị mất đi trong quá trình tiến hành là không tránh khỏi.
- Khi siêu ly tâm một số protein quá nhỏ không lắng cặn cùng đã bị loại trong n−ớc nổi, giai đoạn ly tâm tiếp theo một số protein tạp bị loại trong cặn bỏ đi (có ảnh) biểu hiện trên điện di mẫu sạch rất nhiều băng protein tạp biến mất. Sau siêu ly tâm cô đặc tới 50 lần nh−ng hàm l−ợng protein toàn phần giảm đi.
Chúng tôi lấy 6 loạt qua các giai đoạn siêu lọc, siêu ly tâm, tinh chế để thấy rõ sự thay đổi qua các công đoạn tinh chế.
Bảng 23: Hàm l−ợng protein toàn phần qua các công đoạn so sánh với thể tích cô đặc
Hàm l−ợng protein có trong văcxin qua các giai đoạn (àg/ml) TT Mẫu
Tr−ớc SL Sau SL Sau SLT Sau TC
Độ cô đặc V sau SL 1 IPVv/02/3 42,7673 1095,18 /25,6 996,65 47,5 57,0 lần 2 IPVv/03/3 32,285 1382,4 /42,8 962,26 47,5 41,0 lần 3 IPVv/04/3 60,79 1779,66 /29,3 387,39 45,3 45,5 lần 4 IPVk/11/1 94 1540,65 /16,4 381,86 31,5 17,0 lần 5 IPVk/10/2 83,14 2099,68 /25,3 306,00 31,5 33,33 lần 6 IPVk/07/3 105 2099,68 /19,9 411,71 31,5 25,67 lần
Chúng tôi lấy 6 loạt t−ơng ứng với các giai đoạn làm sạch văcxin và kiểm tra hàm l−ợng protein trong đó có 1 mẫu văcxin týp 1, 1 mẫu văcxin týp 2, 4 mẫu văcxin týp 3 kết quả cho thấy :
- Sau siêu lọc hàm l−ợng protein đều tăng lên từ 16,4 lần cho đến 42,8 lần, đồng thời thể tích văcxin thu đ−ợc giảm xuống từ 17 lần cho đến 57 lần. Tuy vậy 2 tỷ lệ này không t−ơng đ−ơng nhau đối với mỗi mẫu. Mẫu IPVV/02/03 hàm l−ợng protein sau siêu lọc tăng lên 25,6 lần, mức độ cô đặc thể tích sau siêu lọc 57,0 lần, điều này chỉ ra rằng trong quá trình siêu lọc một l−ợng protein đã bị mất đi.
- Sau siêu ly tâm hàm l−ợng protein của cả 6 mẫu so với hàm l−ợng protein sau siêu lọc đều thấp hơn, nh− vậy quá trình siêu ly tâm tiếp tục làm mất bớt protein.
- Sau tinh chế hàm l−ợng protein giảm mạnh, hàm l−ợng protein chỉ còn ở mức 31,5 àg/ml đến 47,5 àg/ml. Nh− vậy quá trình tinh chế qua cột gel có hiệu quả làm sạch cao nhất nếu các protein bị loại chỉ là protein tạp.
Nguyên lý của quá trình tinh chế qua cột gel là sử dụng gel anion yếu để tinh sạch protein đặc hiệu. Bởi vì chính anion này đã "đẩy" protein cùng "dấu" xuống còn cation sẽ bị hấp phụ tại hạt gel, dùng PB đệm trung tính để đẩy protein xuống. Phần tinh chế này rất cần gel phải sạch, chiều dài cột càng cao càng tinh chế tốt nhất vì dựa vào tính rơi tự do của hạt ng−ời ta thiết lập công thức tính gel :
Số l−ợng gel = h ìπì R2
Trong đó : h là chiều cao cột gel (chúng tôi chọn 40-45 cm) R là bán kính của cột gel.
Trong đó huyền dịch gel là 70% nên phải tính đủ gel mới nhồi cột tốt. Do kích thức của polio là 6,8.106 nên ng−ời ta chọn CL-6B là kích th−ớc hạt của Sepharose sử dụng.
ảnh 12 : điện di tinh chế các giai đoạn
Chúng tôi tiến hành chạy điện di các mẫu văcxin qua 3 giai đoạn của quá trình tinh chế để xác định mức độ tinh sạch của sản phẩm.
Theo kết quả từ ảnh 12 cho thấy :
- Đối với mẫu văcxin týp 1 : mẫu sau siêu lọc cho hình ảnh rất nhiều “band” phụ (của protein không đặc hiệu), mẫu sau siêu ly tâm cho hình ảnh sạch hơn nh−ng vẫn còn
nhiều “band” phụ, mẫu sau tinh chế (qua cột gel) chỉ còn 3 “band” t−ơng ứng vùng 35,5kDa ; 35kDa ; 26,4kDa đây là 3 “band” đặc hiệu của virut bại liệt. Nh− vậy mẫu sau tinh chế của văcxin týp 1 đạt yêu cầu về độ sạch.
- T−ơng tự nh− vậy mẫu văcxin týp 2 và týp 3 kết quả điện di cho thấy hình ảnh cột sau tinh chế là sạch chỉ còn lại 3 “band” đặc hiệu của virut bại liệt.
Chúng tôi lấy mẫu văcxin týp 3 qua các giai đoạn của quá trình tinh chế quan sát d−ới kính hiển vi điện tử cũng để xác định mức độ sạch của sản phẩm qua từng giai đoạn.
ảnh 13a : Hình ảnh KHVĐT typ III sau siêu lọc (ì 120.000 lần)
ảnh 13b : Hình ảnh KHVĐT typ III sau siêu ly tâm (ì 200.000 lần)
ảnh 13c : Hình ảnh KHVĐT typ III sau tinh chế (ì 200.000 lần)
Kết quả ở hình 13a : hình ảnh d−ới kính hiển vi điện tử (mẫu văcxin týp 3 sau siêu lọc) với độ phóng đại ì 120.000 lần cho thấy hạt virut lẫn rất nhiều thành phần tạp nh− xác tế bào…
Kết quả ở hình 13b : hình ảnh d−ới kính hiển vi điện tử (mẫu văcxin týp 3 sau siêu ly tâm) với độ phóng đại ì 200.000 lần cho thấy hạt virut đã sạch hơn rất nhiều so với hình ảnh hạt virut ở hình 13a
Kết quả ở hình 13c : hình ảnh d−ới kính hiển vi điện tử (mẫu văcxin týp 3 sau tinh chế qua cột gel) với độ phóng đại ì 200.000 lần cho hình ảnh chỉ còn lại các hạt virut bại liệt.