- Văcxin bại liệt bất hoạt (IPV) hiện nay đ−ợc khuyến cáo sử dụng ở Mỹ.
- Cho đến những năm gần đây, trẻ em của Mỹ đã dùng OPV là văcxin vẫn đ−ợc sử dụng ở nhiều n−ớc khác bởi vì nó dễ cung cấp, giá không đắt và bảo vệ ng−ời trong cộng động hiệu quả hơn IPV. OPV là văcxin dạng n−ớc dùng cho trẻ em qua đ−ờng uống, chứa virut sống giảm độc nh−ng cũng có một số rất nhỏ có thể đột biến và gây nên liệt cho trẻ em sau khi dùng văcxin. Cứ khoảng 3 triệu trẻ em đ−ợc uống văcxin có thể có 1 trẻ bị liệt do uống văcxin.
- OPV đ−ợc dùng ở Mỹ tr−ớc kia bởi nó đã bảo vệ ng−ời trong cộng đồng ở qui mô lớn nó hiệu quả hơn IPV, khi virut bại liệt hoang dại vẫn có mặt. Hiện nay, virut bại liệt hoang dại đã đ−ợc thanh toán khỏi miền Bắc và miền Nam n−ớc Mỹ, IPV đã khuyến cáo để thay cho OPV bởi vì IPV chứa virut chết, nó không thể đột biến và gây nên bất kỳ tai biến nào. Vì vậy sẽ không có rủi ro liên quan đến tiêm văcxin IPV.
- Mặc dù virut bại liệt hoang dại đ−ợc thanh toán ở Mỹ đã trên 20 năm, nh−ng các quốc gia ở Tây bán cầu và một số nơi khác trên thế giới vẫn còn rất phổ biến. Các vụ dịch bại liệt vẫn còn xuất hiện ở Châu á, Châu Phi. Vậy n−ớc Mỹ vẫn phải tiếp tục dùng văcxin.
- Theo Tổ chức Y tế Thế giới, mục tiêu đặt ra là h−ớng tới thanh toán bệnh Bại liệt trên toàn thế giới vào năm 2005. Nếu mục tiêu đó đạt đ−ợc và có thể khẳng định rằng bại liệt đã đ−ợc thanh toán, thì văcxin bại liệt sẽ không cần thiết phải sử dụng lâu dài nữa (giống nh− văcxin phòng bệnh đậu mùa), nh−ng cho đến nay bệnh bại liệt do virut Sabin hoang dại đang còn l−u hành ở một số n−ớc nh−ấn Độ, Pakistan, vùng Caribe và Châu Phi và gần đây nhất đã có tới hơn 300 ca mắc bại liệt ở Indonexia do vậy việc dùng văcxin uống (OPV) vẫn cần thiết. Tuy nhiên ở một số n−ớc đã thanh toán bại liệt qua nhiều năm nên dùng văcxin bại liệt bất hoạt (IPV) theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2003.
1.4 Chiến l−ợc sử dụng văcxin IPV trên thế giới - Liều dùng khuyến cáo
- Trẻ em 4 liều IPV ở các lứa tuổi:
+ Liều 1 ở trẻ 2 tháng tuổi + Liều 2 ở trẻ 4 tháng tuổi
+ Liều 3 ở trẻ 6 đến 18 tháng tuổi
- Ng−ời lớn:
+ Hầu nh− không dùng vì đã đ−ợc dùng từ nhỏ.
+ Những ng−ời này ở nhóm có nguy cơ cao và nếu cần phải tiêm phòng văcxin bại liệt. 1. Những ng−ời đi du lịch trên thế giới vào những khu vực còn có virut Bại liệt hoang dại. 2. Những ng−ời làm việc trong phòng thí nghiệm mà phải tiếp xúc với Polio.
3. Những ng−ời chăm sóc y tế có liên quan đến bệnh nhân bị Bại liệt.
Những ng−ời trong 3 nhóm này nếu ch−a bao giờ tiêm phòng văcxin thì nên tiêm 3 liều IPV vào thời gian:
+ Liều 1 ở bất kỳ thời gian nào + Liều 2 từ 1 đến 2 tháng sau liều 1 + Liều 3 từ 6 đến 12 tháng sau liều 2
Những ng−ời trong 3 nhóm này đã đ−ợc tiêm 1 hoặc 2 liều rồi thì nên tiêm 1 đến 2 liều nữa thì sẽ đ−ợc bảo vệ an toàn. Nếu những ng−ời trong 3 nhóm này đã dùng 3 hoặc hơn 3 liều văcxin IPV hoặc OPV tr−ớc đó, thì có thể tiêm 1 liều tăng c−ờng IPV.
Những ng−ời không nên tiêm IPV:
- Những ng−ời bị dị ứng với các kháng sinh nh− Neomycin, Steptomycin, Polymycin B thì không nên dùng.
- Bất kỳ ai bị phản ứng trầm trọng với IPV rồi thì không nên tiêm.
Những ng−ời chờ đợi:
- Bất kỳ ai đã bị ốm nặng trong lịch trình tiêm phải chờ khỏi hãy tiêm còn nếu cảm lạnh thì có thể tiêm đ−ợc.
Những rủi ro khi dùng IPV:
- Những ng−ời tiêm đôi khi s−ng ở vết tiêm.
- Văcxin dùng hiện nay ch−a phát hiện có vấn đề gì khi tiêm IPV Liều 0,5 ml Typ I: 40 đơn vị D kháng nguyên D E-IPV Typ II: 8 đơn vị D
Typ III: 32 đơn vị D
Dùng IPV
- An toàn cho bệnh nhân bị HIV (suy giảm miễn dịch) và mang thai. Không dùng OPV cho những bệnh nhân trên.
Atlanta - Mỹ)
Có 3 cách sử dụng văcxin (dùng 4 liều theo thời gian ghi trên)
Cách 1: 2 liều tiêm IPV và 2 liều tiếp theo là OPV (Liều 1,2: IPV; liều 3,4: OPV) Cách 2 : Dùng hoàn toàn IPV (4 liều đều tiêm IPV).
Cách 3 : Dùng hoàn toàn OPV (4 liều đều dùng OPV).
* Các n−ớc đ∙ sử dụng văcxin bại liệt bất hoạt (IPV): Mỹ, Ireland, Đức, Pháp, Đan Mạch, Nhật Bản (chúng tôi ch−a liệt kê hết đ−ợc các n−ớc đã sản xuất đ−ợc IPV vì các n−ớc này lại bán IPV cho các n−ớc khác).
* Giá văcxin IPV
- Do xu h−ớng trên thế giới sử dụng văcxin hỗn hợp văcxin bại liệt bất hoạt với các văcxin khác nh− bạch hầu, ho gà, uốn ván, nên không có đơn giá của văcxin Bại liệt Bất hoạt.
- Văcxin bại liệt bất hoạt đ−ợc Pasteur Merieur chào với giá một liều văcxin bán thành phẩm là khoảng 3 USD. Tại Việt Nam 1 liều văcxin bại liệt bất hoạt giá (đại lý) : 54.500đ/liều ; Giá đến ng−ời sử dụng : 70.000đ/liều (2005). CDC cho rằng văcxin bại liệt bất hoạt (IPV) đắt gấp 5 lần văcxin bại liệt sống (OPV).
ở Việt Nam, giá nhập cho ng−ời sử dụng của văcxin IPV gấp 90 lần giá văcxin OPV (2005)
Ch−ơng II
Vật liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu sản xuất
2.1.1 Chủng virut Sabin gồm 3 týp do Viện Bại liệt Nhật bản cung cấp
- Chủng bại liệt typ 1 : WHO- IS-90C
Chủng có nguồn gốc từ chủng Sabin (SO), đ−ợc cấy truyền 2 lần (SO+2). - Chủng bại liệt typ 2 : IIS - 90A
Chủng có nguồn gốc từ chủng Sabin (SO), đ−ợc cấy truyền 2 lần (SO+2). - Chủng bại liệt typ 3 : IIIS-79A
Chủng có nguồn gốc từ chủng Sabin (SO),đ−ợc cấy truyền 3 lần (SO+3).Và 2 lần chọn lọc bằng cách tạo đám hoại tử (SO+3+2 plaque). Hay còn gọi là chủng RSO+2.
2.1.2 Tế bào
Sử dụng hai loại tế bào
- Tế bào thận khỉ Macaca mulatta tiên phát 1 lớp hoặc tế bào thận bào thai khỉ .
- Tế bào th−ờng trực vero: Do Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và dự phòng (CDC) Atlanta, Mỹ cung cấp từ đời thứ 135
2.1.2.1 Tế bào thận khỉ tiên phát và thứ phát
Khỉ loài Macaca mulatta.
ảnh 1 : Đàn khỉ nuôi tại đảo Rều – Quảng ninh - Khỉ tr−ởng thành từ 2 đến 2,5kg
- Khỉ bào thai từ 4 đến 5 tháng tuổi
Khỉ đ−ợc lựa chọn theo tiêu chuẩn của TCYTTG giống nh− sản xuất OPV: Khỉ đ−ợc chọn khi các thử nghiệm d−ới đây âm tính (-)
- Kiểm tra kháng thể SV40 : Ph−ơng pháp trung hoà trên nuôi cấy tế bào JVKT - Kiểm tra kháng thể SIV bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán HIV của ng−ời
- Kiểm tra kháng thể Foamy virut bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch huỳnh quang - Kiểm tra M.tuberculosis bằng thử nghiệm trong da khỉ (test bì)
- Kiểm tra kháng thể bại liệt bằng ph−ơng pháp trung hoà vi l−ợng trên nuôi cấy tế bào Hep2C
* Tách và nuôi tế bào thận khỉ tiên phát :
Mục đích của ph−ơng pháp là lựa chọn tách đ−ợc nhiều tế bào sống nhất, lựa chọn đ−ợc môi tr−ờng nuôi thích hợp nhất cho tế bào phát triển và phù hợp với môi tr−ờng gây nhiễm cho hiệu giá văcxin đơn typ cao. Sử dụng các ph−ơng pháp và kỹ thuật nuôi cấy tế bào thận khỉ 1 lớp nh− sản xuất văcxin bại liệt. Tế bào đ−ợc tách từ cặp thận pha vào môi tr−ờng nuôi để có hỗn dịch tế bào. Hỗn dịch tế bào đạt 7.104 tế bào/ml. Dùng chai Roux 1,2 lít có diện tích bề mặt 250 cm2 cho 170 ml hỗn dịch tế bào (có 10% huyết thanh bê) và ủ ở 370C. Thay môi tr−ờng vào ngày thứ 6-7, theo dõi 1-2 ngày chọn các chai tế bào kín 1 lớp đạt yêu cầu để gây nhiễm với virut bại liệt chủng Sabin.
*Tách tế bào thận bào thai khỉ Macaca Mulatta
Khỉ mẹ có thai khoảng 4 đến 5 tháng tuổi, mổ lấy thai, khỉ mẹ đ−ợc khâu nh− mổ đẻ. Bào thai đ−ợc xử lý tuần tự nh− khỉ tr−ởng thành. Lấy thận, truyền dung dịch trypsin 0,25% trong đệm có citrat (TCD). Bóc màng thận, cắt nhỏ trong chai chứa dung dịch dispase. Sau 10 đến 15 phút lại chắt dung dịch dispase (có chứa tế bào đ−ợc tách ra), cho tiếp dung dịch dispase quay cho tới khi thận đ−ợc tách hết. Ly tâm. Chắt bỏ n−ớc nổi. Dùng dung dịch Hanks ly tâm lại 1 lần nữa. Lọc tế bào. Đếm tế bào giống nh− thận khỉ tr−ởng thành. Khi tế bào kín 1 lớp có thể cấy truyền 3 đời liên tiếp dùng để sản xuất.
2.1.2.2 Tế bào th−ờng trực (vero)
Tế bào gốc đ−ợc nhận từ CDC, đời 135. Từ đó cấy truyền đến đời 140 là ngân hàng tế bào dùng sản xuất (MWCB). Nuôi trên chai thuỷ tinh 1,2 lít (250 cm2- chai Roux)
môi tr−ờng M199 có 5-10% huyết thanh bào thai. Một chai th−ờng cấy truyền thành 4 đến 5 chai. Sau 3 đến 4 ngày chọn chai kín 1 lớp gây nhiễm với chủng Sabin nh− trên tế bào thận khỉ. Quá trình nuôi và gây nhiễm cũng giống nh− nuôi tế bào thận khỉ điểm khác biệt là sử dụng môi tr−ờng nuôi là DMEM hoặc M199 và môi tr−ờng gây nhiễm là M199.
2.1.3 Các loại môi tr−ờng
+ Môi tr−ờng dùng tách tế bào thận khỉ: Công thức và cách pha (P.MT
POLIOVAC).
- Dung dịch Hanks
- Dung dịch Trypsin 0,25% trong đệm PBS có thêm 10 axit amin và glucose - Dung dịch Versen 0,25% trong đệm PBS.
- Dung dịch Trypsin diluent - Dung dịch Trypsin citrat diluent - Dung dịch Dispase
- Dung dịch Trypsin 0,25% trong TCD.
+ Các môi tr−ờng sinh tr−ởng
- Môi tr−ờng LHE : 50% (Lactalbumin 0,5% trong Hanks)+ 50% EAGLE trong Hanks
- Môi tr−ờng EAGLE trong đệm Hanks - Môi tr−ờng DMEM trong đệm Hanks - Môi tr−ờng M199 trong đệm Hanks
+ Các môi tr−ờng duy trì
- Môi tr−ờng LHE: 50% (Lactalbumin 0,5% trong Earle) + 50% EAGLE trong đệm Earle với glucose 3,0 g/ lít, với NaHCO3 đủ để pH = 7,3-7,4
- Môi tr−ờng Eagle trong đệm Earle glucose cao, với NaHCO3 đủ để pH
≥ 7,4
- Môi tr−ờng DMEM trong đệm Earle glucose cao, với NaHCO3 đủ để pH ≥ 7,4 - Môi tr−ờng M199 trong đệm Earle glucose cao, với NaHCO3 đủ để pH ≥7,4
2.1.4 Gây nhiễm virut
Nguyên tắc chung : Tỷ lệ gây nhiễm sử dụng nh− trong sản xuất văcxin bại liệt uống. Chai nuôi tế bào phát triển kín một lớp, đ−ợc cấy theo từng typ riêng rẽ.
Hỗn dịch : đ−ợc pha trong môi tr−ờng LH3E (hoặc EAGLE glucose cao, M199 glucose cao), theo liều gây nhiễm 1 CCID50/300 tế bào. Mỗi chai thuỷ tinh có 34 triệu tế bào. Thời gian hấp phụ 1 giờ ở 330C. Sau đó cho thêm đủ 100ml môi tr−ờng duy trì.
- ủ ở 330C - 33,50C theo dõi sự huỷ hoại của tế bào trên các môi tr−ờng đó thông th−ờng khoảng ≤ 72 giờ. Gặt các văcxin thô, để riêng rẽ, giữ ở -200C. Đông tan 3 lần, lọc vô trùng qua hệ thống lọc 3àm/0,45àm/0,22 àm. Kiểm tra hiệu giá bằng ph−ơng pháp vi l−ợng (theo th−ờng quy kiểm định của TTKHXSVX Sabin). So sánh hiệu giá thu đ−ợc từ các môi tr−ờng duy trì khác nhau. Lựa chọn loại môi tr−ờng nào cho hiệu giá cao thì sử dụng để sản xuất.
2.1.5 Quá trình cô đặc và tinh chế kháng nguyên
Quá trình cô đặc và tinh chế kháng nguyên gồm các b−ớc sau : Văcxin bại liệt sống (3 týp)
Ly tâm 4000 vòng / phút ì 60 phút / 60C
Lọc qua hệ thống màng lọc 3àm/0,45àm/0,22àm Lọc qua hệ thống siêu lọc Vivaflow
Cô đặc bằng siêu ly tâm lạnh 36.000 vòng/4 giờ/ 60C Lọc 0,22àm
Tinh chế qua cột DEAE Sepharose CL-6B
Sản phẩm sau tinh chế : kháng nguyên bại liệt 3 týp đã tinh sạch
2.1.5.1. Quá trình cô đặc và tinh chế kháng nguyên bằng siêu lọc
Văcxin thu đ−ợc từ ph−ơng pháp sản xuất văcxin bại liệt sống trên nuôi tĩnh hoặc động đ−ợc lấy từ –200C ra đông tan lần 3, ly tâm 4000 vòng /phút /1giờ /60C để bỏ cặn tế bào. Lấy n−ớc nổi, lọc qua 3àm/ 0,45 àm/ 0,22àm (lấy mẫu kiểm tra hiệu giá tr−ớc khi siêu lọc).
Tiếp tục dùng hệ thống siêu lọc để cô đặc văcxin. Hệ thống Vivaflow 200 cm2 của Trung tâm hiện nay là loại dùng cho quy mô phòng thí nghiệm (thể tích 100ml→ 5lít). Kênh tuần hoàn "Flip-Flow" mỏng tạo dòng chảy với vận tốc tiếp tuyến lớn mà chỉ cần công suất bơm nhỏ và không cần giá lọc chịu áp lực. Mặt ngoài trong suốt, dễ dàng kiểm soát thể tích giữ và tình trạng của màng. Một module có diện tích 200 cm2 có thể cô 5000ml thành 100ml
trong vòng 6 - 7 giờ (lấy mẫu kiểm tra hiệu giá).
Chất liệu lọc là polyethersulfone, cỡ lọc 100.000 M WCO. Độ t−ơng thích hoá học pH 1-14. Thể tích giữ của module là 1,5ml; Thể tích tuần hoàn tối thiểu < 10ml; Thể tích không thu hồi đ−ợc < 0,5 ml.
Điều kiện hoạt động : Dòng bơm 200 → 400ml/phút; áp suất tối đa 3bar; nhiệt độ tối đa 600C. Quá trình siêu lọc đã loại bỏ một số thành phần muối vô cơ, các axit amin phân tử nhỏ, các mảnh nhỏ của xác tế bào, n−ớc có trọng l−ợng phân tử nhỏ hơn 100.000 dalton vừa làm cho hỗn dịch đặc lại đồng thời loại bỏ một số protein tạp.
ảnh 2 : Hệ thống siêu lọc
2.1.5.2 Quá trình cô đặc và tinh chế kháng nguyên bằng siêu ly tâm
Sau cô đặc tiếp tục tinh chế bằng siêu ly tâm. Quá trình siêu ly tâm gồm 2 b−ớc : B−ớc 1 : Ly tâm 36.000 vòng /phút/60C/ 4giờ. Lấy cặn, bỏ n−ớc nổi (kiểm tra n−ớc nổi để xác định có bị mất khi siêu ly tâm không). Trong n−ớc nổi có một số protein có trọng l−ợng phân tử < 100.000dalton đã bị loại. Cặn đ−ợc hoà vào dung dịch PB 0,1M đề lắc nhẹ qua đêm ở 40C. Sử dụng siêu âm phá tế bào và làm tách rời các hạt virut.
B−ớc 2 : Ly tâm 15.000 vòng /phút/60C/ 30phút. Lấy n−ớc nổi, bỏ cặn (kiểm tra cặn xem mức độ mất virut). Trong cặn bỏ đi có một số protein tạp có trọng l−ợng phân tử > trọng l−ợng phân tử hạt virut đã bị loại. Lấy mẫu kiểm tra hiệu giá sau siêu ly tâm.
ảnh 3 : Máy siêu ly tâm
2.1.5.3 Tinh chế
Mẫu sau siêu ly tâm đ−ợc lọc vô trùng tr−ớc khi chạy tinh sạch.
Dùng cột DEAE Sephrose CL-6B : đệm 0,1M PB để tinh khiết văcxin. - Tuỳ l−ợng mẫu và loại cột để tính Gel sử dụng
- Rửa Gel - Nhồi cột Gel - Chạy mẫu
- Lấy các phân đoạn thu đ−ợc
- Chạy điện di để chọn các phân đoạn sạch
- Kiểm tra các hiệu giá các phân đoạn sạch. Chọn hiệu giá cao hộn lại.
Đổi đệm trong quá trình siêu lọc: đệm 0,1M PB, không có các cation Ca2+, Mg2+, PO42- và đỏ phenol : Mẫu sau siêu lọc đ−ợc tiếp tục siêu lọc bằng cách thêm liên tục đệm bằng l−ợng hỗn dịch đ−ợc cô đặc cuối cùng cho tới khi mẫu cuối cùng trắng hoàn toàn. Thời gian bằng thời gian siêu lọc.
ảnh 4 : Cột tinh chế
2.1.5.4 Kiểm tra văcxin tinh chế qua các giai đoạn
Sử dụng ph−ơng pháp điện di để xem sự xuất hiện protein đặc hiệu của polio ở các phân đoạn 35,5 kDa ; 30,0 kDa ; 26,4 kDa và 7,4 kDa so với thang chuẩn
*Ph−ơng pháp điện di trên gel polyacrylamide (Laemmli (1970), U.K., Nature, 227-680)
Điện di trên gel polyacrlamide th−ờng đ−ợc sử dụng để tách riêng các băng protein có trọng l−ợng phân tử khác nhau. Trong ph−ơng pháp này, gel đ−ợc đổ giữa hai bản thuỷ tinh mỏng theo ph−ơng thẳng đứng.
*Công thức đổ gel :
(1) Công thức đổ gel cô:
- H2O 2,46 ml - Tris-HCL 0,5M pH=8,8 1,25 ml - Glycerol 50% 2 ml - SDS 10% 50 àl - APS 10% 50 àl - Bis-acrylamide 4,2 ml - TEMED 8 àl (2) Công thức đổ gel tách: - H2O 1,7 ml