Sử dụng ph−ơng pháp nuôi cấy trực tiếp trên 2 loại môi tr−ờng : thioglycolate và soybean casein, môi tr−ờng đóng 20 ml/ ống thử. Mỗi bộ ống thử gồm 1 ống thioglycolate và 1 ống soybean casein
Mỗi mẫu thử 5 bộ ống thử, 1ml mẫu/ ống thử
Mỗi lô môi tr−ờng : thioglycolat và soybean casein tr−ớc khi dùng để thử vô trùng đều phải đ−ợc kiểm tra độ nhậy và tính ức chế.
Sau thử nghiệm môi tr−ờng thioglycolate đ−ợc ủ 33-350C môi tr−ờng soybean casein đ−ợc ủ 20-250C
Thời gian theo dõi : ít nhất là 2 tuần, nếu nghi ngờ thì phải cấy truyền
Mẫu thử nghiệm đạt vô trùng nếu trong 2 tuần mầu chỉ thị của môi tr−ờng thioglycolate không mất và đồng thời môi tr−ờng soybean casein trong suốt không bị vẩn đục.
2.2.3.9Xác định hàm l−ợng Formaldehyde/liều của văcxin bán thành phẩm và thành phẩm
Đo c−ờng độ màu của 3,5 diacetyl-1,4 dihydroluthidin ở b−ớc sóng 415 nm. Phức chất này đ−ợc tạo thành do formaldehyde phản ứng với acetylaceton với sự có mặt của muối amonia trong môi tr−ờng axít nhẹ.
Tiến hành:
Pha dung dịch formaldehyde chuẩn 0,04% + Hexamethylanetetramine 311 g + N−ớc cất 2 lần vừa đủ 1000 ml Pha dung dịch acetylaceton
+ Amonium acetate 150 g + Acetic acid 3 ml + N−ớc cất vừa đủ 1000 ml
Khi dùng dung dịch formaldehyde chuẩn 0,04% pha loãng 10 lần (pha bằng bình định mức 50ml, pipet chính xác 5 ml) đ−ợc chuẩn 0,004%
Pha dung dịch formaldehyde chuẩn 0,0002%; 0,0004%; 0,0008%; 0,0012% Bảng 3 : Công thức pha dung dịch formaldehyde chuẩn
Dung dịch formaldehyde chuẩn (%) Nguyên vật liệu
0,0002 0,0004 0,0008 0,0012
Dd formaldehyde 0,004% (ml) 0,5 1 2 3
N−ớc cất 2 lần 9,5 9 8 7
Bảng 4 : Pha loãng mẫu thử 10 lần
Mẫu chuẩn
Dung dịch formaldehyde(%) Nguyên vật liệu Mẫu trắng
(N−ớc cất) Mẫu thử 0,0002 0,0004 0,0008 0,0012 Thể tích mẫu (ml) 3 3 3 3 3 3 Dd acetylaceton (ml) 3 3 3 3 3 3 Trộn đều bằng máy trộn
Đun cách thuỷ 1000C trong 15 phút
Để nguội, đo quang phổ ở b−ớc sóng 415 nm Kết quả:
Căn cứ vào độ hấp phụ của dung dịch formalđehyde chuẩn và nồng độ formaldehyde t−ơng ứng để dựng đ−ờng chuẩn. Xử lý số liệu theo ch−ơng trình vẽ đồ thị trong Excel của máy tính, xây dựng đ−ợc ph−ơng trình y = ax + b. Dựa theo đ−ờng chuẩn tính ra hàm l−ợng formaldehyde của mẫu.
2.2.3.10 Xác định hàm l−ợng protein/liều của văcxin bán thành phẩm và thành phẩm
Xác định hàm l−ợng protein bằng ph−ơng pháp Bradford Dung dịch màu:
+ Coomassie blue G (Serva N035050) 40 mg + Ethanol(EtOH) (absolute) 20 ml
+ H3PO485% 40 ml
+ H2O 40ml
Dung dịch BSA (Bovin Serum Albumin) 100 mg/ml Tiến hành:
Xây dựng đ−ờng chuẩn Protein.
Đo hấp phụ ở b−ớc sóng 595 nm sau 2 phút
Kết quả: Xây dựng đ−ờng chuẩn Protein. Xử lý số liệu theo ch−ơng trình vẽ đồ thị trong Excel của máy tính, xây dựng đ−ợc ph−ơng trình y = ax + b. Dựa theo đ−ờng chuẩn tính ra hàm l−ợng protein của mẫu.
2.2.3.11 Kiểm tra đáp ứng miễn dịch trên khỉ
Văcxin nghiên cứu theo quy trình công nghệ của Nhật Bản (chủng giảm độc lực), nên pha văcxin thử nghiệm theo công thức của Nhật Bản : 2 công thức:
A/ Typ 1, typ 2 : 30 Du ; typ 3 : 50Du B/ Typ 1 : 3 Du; typ2 và typ 3 : 100 Du C/ So sánh với văcxin Pháp (Merieur). Thực hiện nh− sau :
Vật liệu nghiên cứu
* Mẫu văcxin IPVs: Là mẫu văcxin tam liên sản xuất từ chủng Sabin typ 1, 2, 3. Qui trình sản xuất văcxin IPVs đ−ợc tóm tắt nh− sau: Sản xuất văcxin đơn giá theo qui trình của văcxin OPV, sau đó cô đặc bằng siêu lọc và siêu ly tâm, bất hoạt văcxin đơn typ bằng formaldehyd ở 370C trong 12 ngày, sau đó xác định số l−ợng kháng nguyên D và cuối cùng pha văcxin IPVs thành phẩm theo công thức của Nhật Bản tr−ớc đây (typ 1: 30Du, typ 2: 30Du và typ 3: 50Du) và Nhật Bản hiện nay (typ 1: 3Du, typ 2: 100Du và typ 3: 100Du).
* Mẫu văcxin chuẩn sử dụng văcxin IPV của Pháp: IMOVAC POLIO loạt X1201-1 hạn sử dụng 9/2006 và loạt Y0872-3 hạn sử dụng 8/2007
* Khỉ thử nghiệm : Tổng cộng 50 khỉ. Khỉ thử nghiệm cho văcxin pha theo công thức Nhật Bản tr−ớc đây là 45 khỉ chia 3 lô:
- Lô 1 gồm 15 khỉ cho thử nghiệm văcxin IPVs sản xuất trên tế bào thận khỉ tiên phát. - Lô 2 gồm 15 khỉ cho thử nghiệm văcxin IPVs sản xuất trên tế bào vero.
- Lô 3 gồm 15 khỉ cho thử nghiệm văcxin IPV chứng của Pháp IMOVAC POLIO loạt X1201-1 hạn sử dụng 9/2006
Và 5 khỉ thử nghiệm văcxin IPVs pha theo công thức của Nhật Bản hiện nay. * Tế hào: Hep2-C của WHO kín một lớp
* Văcxin bại liệt sống đơn typ 1,2,3 đã biết hiệu giá
* Phiến nhựa đáy dẹt, 96 giếng vô khuẩn và các dụng cụ hoá chất khác đủ cho thử nghiệm xác định kháng thể.
Ph−ơng pháp nghiên cứu
B−ớc 1: Chọn khỉ: Khỉ khoảng 1 năm tuổi có trọng l−ợng từ 1,0kg đến 1,5kg khoẻ mạnh, huyết thanh khỉ tại nồng độ pha loãng1/4 âm tính với cả 3 typ bại liệt.
B−ớc 2: Pha mẫu văcxin và tiêm khỉ: Mẫu văcxin IPVs pha theo công thức của Nhật Bản tr−ớc đây và mẫu chuẩn đ−ợc pha 3 nồng độ : A, B, C. Nồng độ A là nồng độ đặc, nồng độ B là nồng độ pha loãng 1/3 bằng môi tr−ờng 199 và nồng độ C là nồng độ pha loãng văcxin 1/9 bằng môi tr−ờng 199. Mỗi nồng độ tiêm 5 khỉ và mỗi khỉ sử dụng 3 liều văcxin cách nhau 21 ngày.
Mẫu văcxin IPVs pha theo công thức của Nhật Bản hiện nay chỉ sử dụng 1 nồng độ đặc (A) và sử dụng 5 khỉ, mỗi khỉ tiêm 3 liều cách nhau 21 ngày.
B−ớc 3: Thu mẫu máu và tách huyết thanh: Máu lấy 4 thời điểm nh− sau: M0: máu đ−ợc lấy ngay tr−ớc khi tiêm liều 1; M1: máu đ−ợc lấy ngay tr−ớc khi tiêm liều 2 và sau khi tiêm liều 1 là 21 ngày; M2: máu đ−ợc lấy ngay tr−ớc khi tiêm liều 3 và sau khi tiêm liều 2 là 21 ngày; M3: máu đ−ợc lấy sau khi tiêm liều 3 là 21 ngày.
Lấy 3ml máu khỉ vào tuyp vô trùng, ly tâm 3000 vòng/ 1 phút/ 10 phút, tách huyết thanh, bảo quản -200C cho đến khi sử dụng.
B−ớc 4: Xác định hiệu giá kháng thể trung hoà bằng ph−ơng pháp trung hoà vi l−ợng
- Huyết thanh đ−ợc pha loãng 1/4 bằng dung dịch n−ớc muối sinh lý 0,9% và bất hoạt tại 560C trong 30 phút; sau đó đ−ợc pha loãng bậc 2 thành 7 nồng độ.
- Pha loãng văcxin bại liệt typ 1,2,3 thành 100 CCID50/0,1ml
- Sử dụng 0,05ml huyết thanh khỉ mỗi nồng độ với 0,05 ml văcxin 100 CCID50/0,1ml tại nhiệt độ 370C trong 180 phút.
- Cho thêm 0,1ml hỗn dịch tế bào Hep2 C với nồng độ 100.000 đến 150.000 tế bào/ ml - ủ phiến ở 370C trong 7 ngày. Đọc kết quả ngày thứ 4, 5 và 7
- Đọc kết quả: Hiệu giá kháng thể là nồng độ pha loãng nhất mà tại đó tế bào bình th−ờng không bị huỷ hoại;
- Nhận định kết quả: Khỉ có đáp ứng miễn dịch khi huyết thanh có hiệu giá kháng thể ≥1/4 và khỉ có đáp ứng miễn dịch bảo vệ khi hiệu giá kháng thể ≥1/16 tại thời điểm sau tiêm mũi 3 (M3)
ảnh 6a : Khu nuôi khỉ tiêm đáp ứng miễn dịch
ảnh 6b : Lấy máu khỉ tiêm đáp ứng miễn dịch
Ch−ơng III
Kết quả và bàn luận
3.1Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất văcxin bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin
3.1.1 Tách tế bào thận khỉ tr−ởng thành bằng ph−ơng pháp truyền dịch trypsin - versen (theo quy trình tách tế bào TKTP sử dụng trong sản xuất văcxin OPV) (theo quy trình tách tế bào TKTP sử dụng trong sản xuất văcxin OPV)
B−ớc 1: Xử lý khỉ: gây mê khỉ (ketamin 20 mg/kg), cắt động mạch cổ đến khi hết máu. Tắm khỉ sạch bằng n−ớc lã, n−ớc cất, bằng dung dịch chloramin B đặc. Buộc 4 chân khỉ vào 4 góc trên t−ờng, dốc ng−ợc đầu xuống.
B−ớc 2: Lấy thận: mổ bụng, lấy 2 thận cùng 2 động mạch chủ bụng cho vào lọ đựng môi tr−ờng vô trùng
B−ớc 3: Truyền dịch
- Cho thận vào hộp lồng đặt trong buồng vô trùng, dùng kéo nhỏ tách ống thận, dùng máy truyền dịch có 2 kim cho vào 2 động mạch chủ bụng, dùng kẹp, kẹp chặt, truyền dịch đều vào 2 thận và thời gian tuỳ thuộc vào 2 quả thận, sao cho dịch versen và trypsin đ−ợc ngấm đều khắp tổ chức thận. Dung dịch versen và trypsin đ−ợc lấy từ âm lạnh, để nhiệt độ phòng, sau đó phải đun cách thuỷ ở 370C trong 1 giờ. Đầu tiên truyền dung dịch versen 0,025%, th−ờng thì truyền versen từ 5-10 phút, thấy máu từ thận ra từ đỏ dần chuyển sang màu của versen, quả thận trắng dần, đều, sau đó truyền dung dịch trypsin 0,25% trong đệm có thêm axit amin và glucose khoảng 7ữ15 phút. Tốc độ truyền 15 ml/phút, với l−ợng 200-250ml cho mỗi dung dịch. Quả thận trắng, căng đều có nghĩa là giai đoạn truyền có kết quả tốt.
B−ớc 4 : Gặt tế bào
Móc một quả thận vào dây có móc ở nút, đậy nút đó vào chai dung tích 200ml, có chứa khoảng 50 ml môi tr−ờng nuôi (đã cách thuỷ ở 370C), lắc nhẹ cho tế bào tan ra môi tr−ờng. Thay nhiều lần bằng các chai và lắc nhẹ nh− vậy. Hỗn dịch tế bào thu từ mỗi lần thay chai đ−ợc đựng vào các chai dung tích 2,5 lít, có chứa 10% huyết thanh bê để lạnh. Hỗn dịch cuối cùng đ−ợc khuấy trên máy khuấy từ.
B−ớc 5 : Đếm tế bào
Pha hỗn dịch tế bào trong môi tr−ờng sinh tr−ởng có 10% huyết thanh bê. Tuỳ chai nuôi cấy loại nào để đ−a số l−ợng tế bào vào.
3.1.2 Nuôi tế bào thận khỉ và tế bào vero
- Tế bào thận khỉ tr−ởng thành Macaca Mulatta - Tế bào thận bào thai khỉ Macaca Mulatta - Tế bào th−ờng trực (vero)
* Ph−ơng pháp nuôi tế bào
- Tế bào đ−ợc tách từ ph−ơng pháp trypsin, hoặc ph−ơng pháp dispase - Môi tr−ờng phát triển : LHE, EAGLE, PARKER(M199), DMEM - Huyết thanh bê (hãng Gibco)
- Chai dẹt 1,2 lít (hãng OSI của Pháp-250cm2) - Chai nhựa cỡ số 2 (hãng OSI của Pháp) - Tủ ấm, buồng ấm nuôi tế bào 370C.
Nuôi trên chai thuỷ tinh 1,2 lít (250cm2) : Hỗn dịch tế bào lấy từ ph−ơng pháp tách. Đ−a vào chai thuỷ tinh 1,2lít (250cm2)): 170 ml với hỗn dịch tế bào 7.104 tế bào/ml
- Nhiệt độ nuôi tế bào 370C
- Thay môi tr−ờng ở ngày thứ 5 hoặc thứ 6
- Sau khi thay môi tr−ờng 2 ữ 3 ngày chọn những chai tế bào đủ tiêu chuẩn: kín, m−ợt 1lớp để gây nhiễm (typ 1, 2 hoặc 3 do ng−ời điều hành sản xuất quyết định). Nuôi trên các loại môi tr−ờng phát triển, lựa chọn môi tr−ờng nào thích hợp nhất.
Sau quá trình nghiên cứu, lựa chọn đã chọn đ−ợc môi tr−ờng sinh tr−ởng và môi tr−ờng duy trì thích hợp cho các loại tế bào nghiên cứu theo bảng sau:
Bảng 5 : Môi tr−ờng sinh tr−ởng và môi tr−ờng duy trì của các loại tế bào
TT Loại tế bào Số chai
Roux / cặp thận Môi tr−ờng phát triển Môi tr−ờng duy trì 1
Thận khỉ bào thai 20 Eagle hoặc M199 +10% FBS Eagle hoặc M199 2 Thận khỉ tr−ởng thành 120 LHE + !0% BCS LH3E 3 Tế bào th−ờng trực(vero) cấy truyền 1→ 4 - 5 DMEM hoặc M199 + 10% FBS M199
Với tế bào thận khỉ tr−ởng thành chúng tôi đã thử nghiệm cả đời tiên phát đời thứ phát đều cho bào phát triển tốt ở môi tr−ờng LHE + 10% huyết thanh bê.
vào ngày thứ 3-4, và chỉ phát triển tốt trên môi tr−ờng M199, Eagle, hoàn toàn tốt nếu dùng huyết thanh bê bào thai.
Tế bào th−ờng trực vero phát triển tốt trên môi tr−ờng DMEM và M199 đặc biệt ổn định nếu dùng huyết thanh bê bào thai
3.1.3 Gây nhiễm
Hiệu giá thu đ−ợc từ gây nhiễmvirut bại liệt trên các tế bào trên nh− sau :
3.1.3.1 Typ 1
Bảng 6: Hiệu giá 13 loạt văcxin bại liệt typ 1 sản xuất trên tế bào thận khỉ tr−ởng thành TT Loạt tế bào thận khỉ tiên phát Đời tế bào sử dụng Số chai Thể tích văcxin thu đ−ợc Hiệu giá Lg CCID50/ml 1 P0 08 0,7 7,62 2 P1 10 0,9 8,25 3 KTT551 P2 20 1,8 8,19 4 P0 10 0,9 8,18 5 P1 8 0.7 8,15 6 KTT526 P2 10 0,9 8,21 7 P0 10 0,9 8,05 8 P1 20 1,8 7,78 9 KTT08 P2 10 0,9 8,21 10 KTT389 P0 27 2,5 7,87 11 KTT390 P0 26 2,5 8,127 12 KTT391 P0 26 2,5 8,37 13 KTT392 P0 27 2,5 8,12
Hiệu giá trung bình 8,069 ± 0,208
Bảng 6 cho thấy : Chúng tôi sử dụng tế bào tách đ−ợc từ thận của 7 khỉ tr−ởng thành để sản xuất văcxin bại liệt týp 1, trong đó có 7 loạt sử dụng tế bào ở đời P0, 3 loạt sử dụng tế bào đời P1, 3 loạt sử dụng tế bào đời P2. Trong số 13 loạt văcxin thu đ−ợc có 1 loạt hiệu giá cao nhất đạt 8,37 lg CCID50/ml, 1 loạt có hiệu giá thấp nhất đạt 7,62 CCID50/ml. Hiệu giá trung bình của 13 loạt văcxin týp 1 đạt 8,07± 0,208
Bảng 7: Hiệu giá 18 loạt văcxin bại liệt typ 1 sản xuất trên tế bào thận khỉ bào thai TT Loạt tế bào thận khỉ bào thai Đời tế bào sử dụng Số chai Thể tích văcxin thu đ−ợc Hiệu giá Lg CCID50/ml 1 P0 8 0,7 8,25 2 BT 01 P1 10 0,9 8,87 3 P0 8 0,7 8,46 4 P1 10 0,9 8,3 5 BT P2 12 1,1 7,88
TT Loạt tế bào thận khỉ bào thai Đời tế bào sử dụng Số chai Thể tích văcxin thu đ−ợc Hiệu giá Lg CCID50/ml 6 P0 8 0,7 8,0 7 P1 10 0,9 7,9 8 BT 06 P2 12 1,1 8,0 9 P0 7 0,6 8,19 10 P1 8 0,7 8,25 11 BT 10 P2 10 0,9 8,13 12 P0 6 0,5 8,81 13 P1 16 1,5 8,28 14 BT 12 P2 12 1,1 8,15 15 BT15 P0 10 8,08 16 P1 10 0,9 8,0 17 BT14 P2 12 1,1 8,0 18 BT16 P0 10 0,9 8,15
Hiệu giá trung bình 8,165 ± 0,223
Từ bảng 7 cho thấy : Chúng tôi sử dụng tế bào tách đ−ợc từ thận của 8 khỉ bào thai để sản xuất văcxin bại liệt týp 1, trong đó có 7 loạt sử dụng tế bào ở đời P0, 6 loạt sử dụng tế bào đời P1, 5 loạt sử dụng tế bào đời P2. Trong số 18 loạt văcxin thu đ−ợc có 1 loạt hiệu giá cao nhất đạt 8,87 lg CCID50/ml, 1 loạt có hiệu giá thấp nhất đạt 7,88 CCID50/ml. Hiệu giá trung bình của 18 loạt văcxin týp 1 đạt 8,165± 0,223
Bảng 8: Hiệu giá 7 loạt văcxin bại liệt typ 1 sản xuất trên tế bào vero
TT Loạt Số chai Thể tích văcxin
thu đ−ợc (lít) Hiệu giá LgCCID50/ml 1 IPVv01/I/04 13 1,2 8,15 2 IPVv02/I/04 14 1,3 8,50 3 IPVv03/I/04 14 1,3 8,37 4 IPVv04/I/04 16 1,5 7,87 5 IPVv05/I/04 20 1,9 7,87 6 IPVv06/I/04 46 4,5 8,50 7 IPVv06/I/04 51 5,0 8,50
Hiệu giá trung bình 8,23± 0,267
Kết quả ở bảng 8 cho thấy trong số 7 loạt văcxin týp 1 sản xuất trên tế bào vero có tới 3 loạt cùng đạt hiệu giá cao nhất đạt 8,5 lg CCID50/ml, 2 loạt hiệu giá thấp nhất đạt 7,87 lg CCID50/ml. Hiệu giá trung bình của 7 loạt văcxin týp 1 đạt 8,23 ± 0,267
Bảng 9: Hiệu giá 13 loạt văcxin bại liệt typ 2 sản xuất trên tế bào thận khỉ tr−ởng thành
TT Loạt Số chai Thể tích văcxin
thu đ−ợc (lít) Hiệu giá LgCCID50/ml 1 IPVk/ 01/II/04 20 1,6 7,56 2 IPVk/ 02/II/04 20 1,8 7,68 3 IPVk/ 04/II/04 20 1,7 7,78 4 IPVk/ 05/II/04 20 1,8 7,7 5 IPVk/ 06/II/04 20 1,7 8,13 6 IPVk/ 07/II/04 9 0,8 8,06 7 IPVk/ 08/II/04 20 1,8 8,18 8 IPVk/ 09/II/04 20 1,7 7,37 9 IPVk/ 23/II/04 20 1,8 7,06 10 IPVk/ 25/II/04 20 1,8 7,56 11 IPVk/ 27/II/04 20 1,8 7,58 12 IPVk/ 32/II/04 15 1,3 7,0 13 IPVk/ 34/II/04 15 1,2 7,05
Hiệu giá trung bình 7,6 ± 0,397
Kết quả ở bảng 9 cho thấy trong số 13 loạt văcxin týp 2 sản xuất trên tế bào thận khỉ