Mẫu sau siêu ly tâm đ−ợc lọc vô trùng tr−ớc khi chạy tinh sạch.
Dùng cột DEAE Sephrose CL-6B : đệm 0,1M PB để tinh khiết văcxin. - Tuỳ l−ợng mẫu và loại cột để tính Gel sử dụng
- Rửa Gel - Nhồi cột Gel - Chạy mẫu
- Lấy các phân đoạn thu đ−ợc
- Chạy điện di để chọn các phân đoạn sạch
- Kiểm tra các hiệu giá các phân đoạn sạch. Chọn hiệu giá cao hộn lại.
Đổi đệm trong quá trình siêu lọc: đệm 0,1M PB, không có các cation Ca2+, Mg2+, PO42- và đỏ phenol : Mẫu sau siêu lọc đ−ợc tiếp tục siêu lọc bằng cách thêm liên tục đệm bằng l−ợng hỗn dịch đ−ợc cô đặc cuối cùng cho tới khi mẫu cuối cùng trắng hoàn toàn. Thời gian bằng thời gian siêu lọc.
ảnh 4 : Cột tinh chế
2.1.5.4 Kiểm tra văcxin tinh chế qua các giai đoạn
Sử dụng ph−ơng pháp điện di để xem sự xuất hiện protein đặc hiệu của polio ở các phân đoạn 35,5 kDa ; 30,0 kDa ; 26,4 kDa và 7,4 kDa so với thang chuẩn
*Ph−ơng pháp điện di trên gel polyacrylamide (Laemmli (1970), U.K., Nature, 227-680)
Điện di trên gel polyacrlamide th−ờng đ−ợc sử dụng để tách riêng các băng protein có trọng l−ợng phân tử khác nhau. Trong ph−ơng pháp này, gel đ−ợc đổ giữa hai bản thuỷ tinh mỏng theo ph−ơng thẳng đứng.
*Công thức đổ gel :
(1) Công thức đổ gel cô:
- H2O 2,46 ml - Tris-HCL 0,5M pH=8,8 1,25 ml - Glycerol 50% 2 ml - SDS 10% 50 àl - APS 10% 50 àl - Bis-acrylamide 4,2 ml - TEMED 8 àl (2) Công thức đổ gel tách: - H2O 1,7 ml - Tris-HCL 1M pH=6,8 312,5 àl - SDS 10% 12,5 àl - APS 10% 25 àl
- Bis-acrylamide 425 àl - TEMED 2àl
• Xử lý mẫu: 50àl mẫu + 12àl dịch đệm phá (SDS sample 5X). Sau đó ủ 100oC trong thời gian 10 phút.
• Mẫu sau khi đã đ−ợc xử lý, tra vào trong bản gel 15 àl/1giếng.
• Quá trình chạy điện di đ−ợc tiến hành d−ới hiệu điện thế 300V, c−ờng độ dòng điện cố định là 40mA, thời gian 45phút.
• Sau khi chạy xong, bản gel đ−ợc gỡ ra và nhuộm trong dung dịch Comasie Brilliant blue, lắc khoảng 2 giờ trên máy lắc, sau đó đổ dịch nhuộm, thay bằng dịch tẩy, lắc trong 30 phút thì đổ dịch tẩy đi cho n−ớc vào và có thể quan sát thấy các băng protein.
2.1.6 Bất hoạt typ 1, typ 2 và typ 3
Trung tâm áp dụng quy trình công nghệ của Nhật bản nên dùng Formaldehyt để bất hoạt. Thời gian bất hoạt 12 ngày. Kiểm tra bại liệt sống còn tồn d− để xác định nồng độ Formaldehyt phù hợp để bất hoạt và thời gian bất hoạt thích hợp. Bất hoạt dùng formalin theo tỷ lệ 1: 4000. Sử dụng chai Nalgen bề mặt trong có tráng silicon để tránh hấp thụ lên bề mặt chai. Nút kỹ cho vào túi kín không cho n−ớc ngấm vào, ngâm trong bể điều nhiệt 370C trong 12 ngày. Kiểm tra bại liệt sống để xác định ngày thứ bao nhiêu thì bị bất hoạt hoàn toàn. Lúc đầu ngày nào cũng lấy mẫu, sau khi nắm đ−ợc khoảng thời gian hỗn dịch bị bất hoạt hoàn toàn thì sẽ lấy mẫu vào ngày thứ 3, sau đó lấy vào ngày thứ 9 và ngày thứ 12. Lọc mẫu đang bất hoạt vào ngày thứ 6. Trung hoà formalin khi bất hoạt kết thúc (lấy mẫu). Văcxin đ−ợc tinh chế và bất hoạt sẽ đ−ợc kiểm tra và xác định kháng nguyên D.