2.2.3.1 Kiểm tra khỉ sạch và số liệu về tế bào Vero dùng cho sản xuất
- Khỉ sản xuất:
+ SV 40 : Ph−ơng pháp trung hoà trên tế bào JVKT + SIV : Bộ sinh phẩm chẩn đoán HIV của ng−ời
+ Foamy : Bộ sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch huỳnh quang + Polio : Ph−ơng pháp trung hoà vi l−ợng trên tế bào Hep2
+ Lao : Bằng ph−ơng pháp tiêm trong da khỉ sử dụng tuberculine
- Vero:
+ Nguồn cung cấp : CDC Atlanta + Đời cấy truyền cho phép
2.2.3.2 Xác định hiệu giá văcxin đơn typ qua các giai đoạn sản xuất
Dùng ph−ơng pháp chuẩn độ vi l−ợng đ−ợc xác định bằng liều gây huỷ hoại 50% tế bào (CCID50). Tế bào đ−ợc sử dụng là tế bào Hep-2C.
Pha loãng mẫu (hỗn dịch virut) bậc 10 từ 10-1 đến 10-9 bằng môi tr−ờng MEM 2% huyết thanh bê bào thai. Sử dụng pipét man loại 200 àl nhỏ 100 àl vào mỗi giếng của phiến 96 giếng đáy phẳng. Nhỏ từ nồng độ 10-5 đến 10-9 mỗi nồng độ nhỏ 8 giếng.
MEM 10% huyết thanh bê bào thai, tách tế bào bằng dung dịch trypsin + EDTA (0,125% + 0,05%), rửa bằng Hanks (-), đếm tế bào bằng buồng đếm, pha hỗn dịch tế bào có mật độ 100.000 TB/ml.
Nhỏ 100 àl hỗn dịch tế bào đã chuẩn bị ở trên vào mỗi giếng của phiến 96. Dùng băng dính dán kín phiến. Để phiến vào tủ ấm 360C. Đọc kết quả vào ngày thứ 5 và7.
Đối với giếng chứng tế bào thay 100 àl hỗn dịch virut bằng 100 àl MEM 2% huyết thanh bê bào thai.
Tính kết quả bằng ph−ơng pháp Karber [28’]: Lg CCID50= L - d(S - 0,5)
L: Lg của độ pha loãng thấp nhất sử dụng trong thử nghiệm D: Sự chênh lệch Lg của các bậc pha loãng
S: Tổng số phần trăm giếng huỷ hoại trong thử nghiệm
2.2.3.3 Xác định typ của văcxin đơn typ bằng thử nghiệm nhận dạng
Sử dụng ph−ơng pháp trung hoà (trung hoà virut bằng kháng huyết thanh đặc hiệu). Dựa vào hiệu giá của văcxin ta pha loãng văcxin thành hỗn dịch virut có hiệu giá 100 CCID50 bằng MEM 2% huyết thanh bê bào thai. Làm t−ơng tự nh− vậy đối với chứng virut typ 1,2,3. Dùng pipet man loại 200 àl nhỏ 50 àl vào mỗi giếng của phiến 96 đáy phẳng, mỗi mẫu nhỏ 12 giếng.
Kháng huyết thanh đặc hiệu cho mỗi typ 1,2,3 đ−ợc pha từ KHT 20 đơn vị /0,1 ml thành KHT 0,5 đơn vị/1ml. Dùng MEM 2% huyết thanh bê bào thai để pha. Sau khi đã chuẩn bị xong KHT 0,5 đơn vị/1ml, dùng pipet man loại 200 àl nhỏ vào mỗi giếng 50 àl. Nh− vậy mỗi mẫu có 12 giếng thì 4 giếng nhỏ KHT typ 1; 4 giếng nhỏ KHT typ 2; 4 giếng nhỏ KHT typ 3. Đối với giếng chứng tế bào ta thay mẫu bằng môi tr−ờng MEM 2% huyết thanh bê bào thai. Dùng băng dính dán kín phiến, để phiến vào trong tủ ấm 360C trong 3 giờ.
Tế bào Hep-2C nuôi bằng MEM 10% huyết thanh bê bào thai đ−ợc tách nh− trên, đếm và pha thành hỗn dịch 100.000 TB/ml.
Sau 3 giờ ủ 360C, lấy phiến ra, bóc băng dính, nhỏ 100 àl hỗn dịch tế bào vào mỗi giếng rồi dán băng dính kín phiến, tiếp tục ủ ở 360C, đọc kết quả vào ngày thứ 7.
Đọc kết quả:
4 giếng có KHT typ 1 tế bào không bị huỷ hoại
4giếng có KHT typ 2 tế bào bị huỷ hoại 4giếng có KHT typ 3 tế bào bị huỷ hoại Giếng chứng virut typ 2:
4giếng có KHT typ 2 tế bào không bị huỷ hoại
4giếng có KHT typ 1 tế bào bị huỷ hoại 4giếng có KHT typ 3 tế bào bị huỷ hoại Giếng chứng virut typ 3:
4giếng có KHT typ 3 tế bào không bị huỷ hoại
4giếng có KHT typ 1 tế bào bị huỷ hoại 4giếng có KHT typ 2 tế bào bị huỷ hoại
Giếng mẫu cần xác định typ nếu là typ 1 khi (giống hình ảnh đối chứng virut typ 1): 4giếng có KHT typ 1 tế bào không bị huỷ hoại
4giếng có KHT typ 2 tế bào bị huỷ hoại 4giếng có KHT typ 3 tế bào bị huỷ hoại
Giếng mẫu cần xác định typ nếu là typ 2 khi (giống hình ảnh đối chứng virut typ 2): 4giếng có KHT typ 2 tế bào không bị huỷ hoại
4giếng có KHT typ 1 tế bào bị huỷ hoại 4giếng có KHT typ 3 tế bào bị huỷ hoại
Giếng mẫu cần xác định typ nếu là typ 3 khi (giống hình ảnh đối chứng virut typ 3): 4giếng có KHT typ 3 tế bào không bị huỷ hoại
4giếng có KHT typ 1 tế bào bị huỷ hoại 4giếng có KHT typ 2 tế bào bị huỷ hoại
2.2.3.4 Kiểm tra an toàn đặc hiệu của văcxin đơn typ trên súc vật thử nghiệm
Tiêm trên 4 loại động vật nhỏ để kiểm tra virut ngoại lai
Chuột ổ giống Swiss (trong 24 giờ sau sinh) ít nhất 10 con. Mỗi con tiêm 0,1 ml vào phúc mạc và 0,01 ml vào não. Theo dõi trong 2 tuần sau tiêm.
Chuột tr−ởng thành giống Swiss trọng l−ợng từ 15-20g/con ít nhất 20 con. Mỗi con tiêm 0,5 ml vào phúc mạc và 0,03 ml vào não. Theo dõi trong 3 tuần sau tiêm.
Thỏ trọng l−ợng 1,5-2,5kg ít nhất 10 con. Mỗi con tiêm 1 ml trong da tiêm 5-7 nốt tiêm và 9 ml vào d−ới da đùi. Theo dõi trong 3 tuần sau tiêm.
Chuột lang trong l−ợng 200-300g ít nhất 5 con. Mỗi con tiêm 5 ml vào phúc mạc. Theo dõi trong 42 ngày sau tiêm.
Mỗi loại súc vật đều có để động vật đối chứng không tiêm mẫu.
Theo dõi súc vật, đọc kết quả vào ngày cuối của thời gian theo dõi : ít nhất 80% súc vật thử nghiệm khoẻ mạnh, tăng trọng bình th−ờng. Nếu chết trong 24 giờ đầu không tính vào kết quả. Sau 24 giờ cần xác định nguyên nhân chết, nếu chết liên quan đến an toàn văcxin thì không đ−ợc đ−a vào kết quả.
2.2.3.5 Xác định qui trình bất hoạt của virut bại liệt
Phát hiện virut bại liệt sống tồn d− trong quá trình bất hoạt (thử nghiệm an toàn) Hỗn dịch đ−ợc lọc bằng màng lọc 0,45 àm và 0,22 àm.
Pha dung dịch formalin 37% theo tỉ lệ 1:20 Cứ 100 ml cho 0,5 ml formalin 37% (1:20)
Cho vào bể điều nhiệt (water bath) 370C có recorder theo dõi nhiệt độ trong suốt thời gian bất hoạt. Thời gian bất hoạt là 12 ngày.
Lấy mẫu sau bất hoạt 3,7,9 và 12 ngày. Ph−ơng pháp thẩm tách loại formaldehyde
áp dụng ph−ơng pháp thẩm tách của Viện sức khoẻ Quốc gia Nhật Bản bằng cách sử dụng typ li tâm (Centrimex) cùng với đệm PB 0,1 M loại bỏ formaldehyde ra khỏi các mẫu văcxin đơn giá bất hoạt sau 3;7;9;12 ngày
Ph−ơng pháp kiểm tra virut sống tồn d− trên tế bào
Sử dụng 0,1 ml mẫu văcxin đơn giá bất hoạt sau 3;7;9;12 ngày đã thẩm tách cho 1 giếng tế bào thận khỉ tiên phát một lớp trên phiến 96 giếng, ủ 360C.
Đọc kết quả vào ngày thứ 3;5;7
Mẫu văcxin còn virut sống thì tế bào bị huỷ hoại (CPE), hiệu giá sẽ đ−ợc tính theo công thức Kaber.
Mẫu văcxin không còn virut sống thì tế bào bình th−ờng không bị huỷ hoại trong suốt thời gian theo dõi.
Theo yêu cầu của TCYTTG virut bị bất hoạt hoàn toàn sẽ không có sự huỷ hoại của tế bào trong suốt thời gian quan sát sau nhiễm.
2.2.3.6 Kiểm tra protein đặc hiệu của virut bại liệt
- Kiểm tra bằng ph−ơng pháp Western-Blot
Ph−ơng pháp Western blot để thử khả năng phản ứng của kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân, kháng thể chuẩn, văcxin hoặc protein thực hiện theo (Towwbin et at.1979). Hoặc protein đ−ợc điện di trên gel polyacrylamide 12,5% sau đó đ−ợc chuyển sang màng polyvinyl-idene-difluoride (PVDF), nhuộm màng tạm thời bằng dung dịch Ponceau 0,1% để đánh dấu vị trí của các băng Marker chuẩn. Phủ màng bằng sữa 5% trong dung dịch đệm Tris-HCl Buffed Solution (TBS 1X). Dùng màng này để phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng Polio trong huyết thanh bệnh nhân (đối với các bệnh nhân đã đ−ợc uống hoặc tiêm văcxin polio). Huyết thanh bệnh nhân đ−ợc pha loãng 500 lần trong dung dịch đệm TBS 1X chứa 5% sữa rồi cho phản ứng với các băng có trên màng. Kháng thể kháng polio đ−ợc phản ứng kháng thể kháng IgG của ng−ời có gắn enzym Horseradish peroxidase (HRP). Phản ứng hiện màu đ−ợc thực hiện với cơ chất 4- choloronapthol.
Các b−ớc thực hiện
Sau khi chạy điện di các mẫu và vácxin chuẩn trên gel Polyacrylamide 12,5%, ta tiến hành chuyển màng theo thứ tự sau :
Chạy Western Blot với hiệu điện thế U =100V, trong thời gian 2 giờ. Sau đó lấy màng nhuộm tạm thời bằng dung dịch ponceau để đánh dấu vị trí của các băng Marker chuẩn bằng bút chì 2B, rồi ta rửa màng 3 lần bằng n−ớc khử ion.
Phủ màng qua đêm ở 4oC bằng 5% sữa pha trong TBS 1X. Rửa màng 3 lần bằng TBS 1X, mỗi lần 5 phút.
Rửa màng 3 lần bằng TBS 1X, mỗi lần 5 phút.
Phủ màng 2 giờ bằng huyết thanh bệnh nhân (đã đ−ợc uống hoặc tiêm vacxin Polio)
Xốp Giấy thấm gel Màng PVDF Giấy thấm Xốp - +
pha loãng 500 lần bằng 5% sữa pha trong TBS 1X, lắc ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 giờ. Rửa màng ba lần bằng TBS 1X, mỗi lần 5 phút.
Rửa màng ba lần bằng TBS 1X, mỗi lần 5 phút.
Phủ màng 2 giờ bằng kháng thể hai (cộng hợp kháng IgG ng−ời gắn HRP) pha loãng 1000 lần bằng 5% sữa pha trong TBS 1X, lắc ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 giờ.
Rửa màng bằng TBS 1X, rửa 2 lần, mỗi lần 5 phút Rửa màng bằng TBS 1X, rửa 2 lần, mỗi lần 5 phút
Bổ sung dịch hiện màu :
5 ml methanol + 15 mg chất hiện màu(4-chloro 3-napthol). 25 ml TBS 1X + 15àl H2O2 30%.
Trộn hai thành phần này với nhau, sau đó ủ màng trong dung dịch chất hiện màu trong thời gian 3-10 phút.
Bệnh nhân uống văcxin bại liệt (OPV), mẫu huyết thanh đã đ−ợc kiểm tra có kháng thể bại liệt (mẫu bệnh phẩm lấy tại phòng thí nghiệm bại liệt chuẩn thức – Viện vệ sinh Dịch tễ trung −ơng), khi xuất hiện mầu chứng tỏ văcxin nghiên cứu có kháng nguyên Polio (Protein đặc hiệu). Cùng làm với văcxin chuẩn (Merier-Pháp)
- Ph−ơng pháp kính hiển vi điện tử:
• Ph−ơng pháp nhuộm âm bản
Vật liệu :
- Mẫu văcxin ,
- L−ới đồng phủ các bon
- Amonium acetate 0,1% , glutaraldehyte - Bacitracin 0,01%
- Uranin acetate 1% ....
Ph−ơng pháp :
Ph−ơng pháp này thực hiện trên giấy parafin theo ph−ơng pháp nhỏ giọt - Bacitracin 0,01% → 5'
- L−ới đồng đ−ợc chuyển sang giọt VR để→15' - Cố định glutaraldehyd 1% →5'
- Nhuộm Uranine acetate 1% → 15'
Để khô soi kính hiển vi điện tử JEM 1010 với độ phóng đại 2000 – 4000 lần
• Ph−ơng pháp đánh dấu miễn dịch gắn vàng và nhuộm âm bản
Vật liệu : Mẫu , mẫu văcxin, kháng thể thỏ tinh chế có ái lực với Polio (của POLIOVAC). Các hoá chất và thuốc nhuộm ....
Ph−ơng pháp :
- Bacitracin 0,01% → 5'( Đặt l−ới đồng lên giọt làm −ớt) - L−ới đồng đ−ợc chuyển giọt s để →15- 20'
- ủ BSA 2% → 20' (để phóng bế các vị trí kháng nguyên không đặc hiệu)
- ủ kháng thể kháng virut bại liệt có gắn vàng → 30' - Rửa 3 lần với BSA-PBS 0,2% 3 lần → 10'
- ủ Protein A gắn vàng fa theo chỉ dẫn để → 30' - Rửa 3 lần với BSA-PBS 0,2% 3 lần → 10' - Cố định glutaraldehyd 1% → 5'
- Rửa PBS 3 lần →10'
- Nhuộm Uranin acetate 1% → 10'
Để khô soi kính hiển vi điện tử JEM 1010 : kiểm tra đánh giá chất l−ợng về mặt hình thái và tính kháng nguyên
Kiểm tra trên kính hiển vi điện tử bằng ph−ơng pháp gắn vàng giữa kháng nguyên và kháng thể.
Kính hiển vi điện tử đ−ợc sử dụng nh− một ph−ơng pháp để kiểm tra độ tinh khiết của virut bại liệt qua các ph−ơng pháp siêu lọc, siêu ly tâm, siêu âm và tinh chế. Đồng thời kiểm tra hình thái đặc hiệu của. Kỹ thuật này đ−ợc làm tại phòng kính hiển vi điện tử của Viện vệ sinh dịch tễ Trung −ơng. Hình ảnh cuối cùng còn nguyên vẹn nghĩa là ph−ơng pháp nghiên cứu đã phù hợp không làm biến đổi hình thái của virut bại liệt.
2.2.3.7 Ph−ơng pháp tính đơn vị kháng nguyên D
Viện Bại liệt Tokyo Nhật bản đã nhiều năm nghiên cứu đã có hệ số hiệu giá của từng typ để chuyển đổi và dùng hiện nay là Du
Typ 1 : 7,19 lgCCID50/ml = 1Du Typ 2 : 6,881 lg CCID50/ml = 1Du
Typ 3 : 6,662 lg CCID50/ml = 1Du
(Du : Angtigen-D unit → đơn vị kháng nguyên D)
2.2.3.8 Kiểm tra tính vô trùng của văcxin đơn giá và văcxin thành phẩm
Sử dụng ph−ơng pháp nuôi cấy trực tiếp trên 2 loại môi tr−ờng : thioglycolate và soybean casein, môi tr−ờng đóng 20 ml/ ống thử. Mỗi bộ ống thử gồm 1 ống thioglycolate và 1 ống soybean casein
Mỗi mẫu thử 5 bộ ống thử, 1ml mẫu/ ống thử
Mỗi lô môi tr−ờng : thioglycolat và soybean casein tr−ớc khi dùng để thử vô trùng đều phải đ−ợc kiểm tra độ nhậy và tính ức chế.
Sau thử nghiệm môi tr−ờng thioglycolate đ−ợc ủ 33-350C môi tr−ờng soybean casein đ−ợc ủ 20-250C
Thời gian theo dõi : ít nhất là 2 tuần, nếu nghi ngờ thì phải cấy truyền
Mẫu thử nghiệm đạt vô trùng nếu trong 2 tuần mầu chỉ thị của môi tr−ờng thioglycolate không mất và đồng thời môi tr−ờng soybean casein trong suốt không bị vẩn đục.
2.2.3.9Xác định hàm l−ợng Formaldehyde/liều của văcxin bán thành phẩm và thành phẩm
Đo c−ờng độ màu của 3,5 diacetyl-1,4 dihydroluthidin ở b−ớc sóng 415 nm. Phức chất này đ−ợc tạo thành do formaldehyde phản ứng với acetylaceton với sự có mặt của muối amonia trong môi tr−ờng axít nhẹ.
Tiến hành:
Pha dung dịch formaldehyde chuẩn 0,04% + Hexamethylanetetramine 311 g + N−ớc cất 2 lần vừa đủ 1000 ml Pha dung dịch acetylaceton
+ Amonium acetate 150 g + Acetic acid 3 ml + N−ớc cất vừa đủ 1000 ml
Khi dùng dung dịch formaldehyde chuẩn 0,04% pha loãng 10 lần (pha bằng bình định mức 50ml, pipet chính xác 5 ml) đ−ợc chuẩn 0,004%
Pha dung dịch formaldehyde chuẩn 0,0002%; 0,0004%; 0,0008%; 0,0012% Bảng 3 : Công thức pha dung dịch formaldehyde chuẩn
Dung dịch formaldehyde chuẩn (%) Nguyên vật liệu
0,0002 0,0004 0,0008 0,0012
Dd formaldehyde 0,004% (ml) 0,5 1 2 3
N−ớc cất 2 lần 9,5 9 8 7
Bảng 4 : Pha loãng mẫu thử 10 lần
Mẫu chuẩn
Dung dịch formaldehyde(%) Nguyên vật liệu Mẫu trắng
(N−ớc cất) Mẫu thử 0,0002 0,0004 0,0008 0,0012 Thể tích mẫu (ml) 3 3 3 3 3 3 Dd acetylaceton (ml) 3 3 3 3 3 3 Trộn đều bằng máy trộn
Đun cách thuỷ 1000C trong 15 phút
Để nguội, đo quang phổ ở b−ớc sóng 415 nm Kết quả:
Căn cứ vào độ hấp phụ của dung dịch formalđehyde chuẩn và nồng độ formaldehyde t−ơng ứng để dựng đ−ờng chuẩn. Xử lý số liệu theo ch−ơng trình vẽ đồ thị trong Excel của máy tính, xây dựng đ−ợc ph−ơng trình y = ax + b. Dựa theo đ−ờng chuẩn tính ra hàm l−ợng formaldehyde của mẫu.
2.2.3.10 Xác định hàm l−ợng protein/liều của văcxin bán thành phẩm và thành phẩm
Xác định hàm l−ợng protein bằng ph−ơng pháp Bradford Dung dịch màu:
+ Coomassie blue G (Serva N035050) 40 mg + Ethanol(EtOH) (absolute) 20 ml
+ H3PO485% 40 ml
+ H2O 40ml
Dung dịch BSA (Bovin Serum Albumin) 100 mg/ml Tiến hành:
Xây dựng đ−ờng chuẩn Protein.
Đo hấp phụ ở b−ớc sóng 595 nm sau 2 phút
Kết quả: Xây dựng đ−ờng chuẩn Protein. Xử lý số liệu theo ch−ơng trình vẽ đồ thị trong Excel của máy tính, xây dựng đ−ợc ph−ơng trình y = ax + b. Dựa theo đ−ờng chuẩn tính ra hàm l−ợng protein của mẫu.
2.2.3.11 Kiểm tra đáp ứng miễn dịch trên khỉ
Văcxin nghiên cứu theo quy trình công nghệ của Nhật Bản (chủng giảm độc lực), nên pha văcxin thử nghiệm theo công thức của Nhật Bản : 2 công thức:
A/ Typ 1, typ 2 : 30 Du ; typ 3 : 50Du B/ Typ 1 : 3 Du; typ2 và typ 3 : 100 Du C/ So sánh với văcxin Pháp (Merieur). Thực hiện nh− sau :
Vật liệu nghiên cứu
* Mẫu văcxin IPVs: Là mẫu văcxin tam liên sản xuất từ chủng Sabin typ 1, 2, 3. Qui trình sản xuất văcxin IPVs đ−ợc tóm tắt nh− sau: Sản xuất văcxin đơn giá theo qui trình của văcxin OPV, sau đó cô đặc bằng siêu lọc và siêu ly tâm, bất hoạt văcxin đơn typ bằng formaldehyd ở 370C trong 12 ngày, sau đó xác định số l−ợng kháng nguyên D và cuối cùng pha văcxin IPVs thành phẩm theo công thức của Nhật Bản tr−ớc đây (typ 1: