Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm a h5n1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm

BKHCN-BYT VVSDT TƯ BKHCN-BYT VVSDT TƯ BKHCN-BYT vvsdt t Bộ khoa học công nghệ Bộ y tế Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ơng 1 Yersin, Hà Nội báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm a/h5n1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm m số : ĐTĐL-2006/02G GS.TSKH.Nguyễn THU VÂN 6374 14/5/2007 Hà nội 2007 Bản quyền 2007 thuộc Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1,Viện VSDTTƯ Đơn xin sao chép bản toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Giám đốc Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1 trừ trờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu Bộ khoa học công nghệ Bộ y tế Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ơng 1 Yersin, Hà Nội báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm a/h5n1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm m số : ĐTĐL-2006/02G GS.TSKH.Nguyễn THU VÂN Hà nội 2007 Bản thảo viết xong tháng 3/2007 Tài liệu này đợc chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài cấp Nhà nớc, mã số ĐTĐL-2006/02G đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ nhà nớc ĐTĐL-2006/02G nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm a/h5n1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm Cố vấn khoa học : GS.TSKH.Hoàng Thủy Nguyên Chủ nhiệm đề tài : GS.TSKH Nguyễn Thu Vân Các cán bộ tham gia TS.Nguyễn Tuyết Nga Thạc sỹ Đinh Thúy Vân KS.Trịnh Tuấn Việt CNSH.Nguyễn Kim Dung Thạc sỹ Đoàn Văn Lu TS.Đỗ Thủy Ngân Thạc sỹ Nguyễn Thu Hằng CNSH.Nguyễn Hoàng Mai Thạc sỹ Nguyễn Bích Thủy TS.Nguyễn Quế Anh TS.Lê Quỳnh Mai Thạc sỹ Nguyễn Lê Khánh Hằng Cơ quan thực hiện : Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng các chữ viết tắt ADN Desoxyribonucleic acid (axít desoxyribonucleic) ARN Ribonucleic acid (axít ribonucleic) BSA Bovine Serum Albumin CCID 50 Cell Culture Infectious Dose 50 (Liều gây nhiễm 50% tế bào) CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng- Mỹ) CPE Cytopathic effect tác động gây hủyhoại tế bào dpi day post infection Ngày sau gây nhiễm E.coli Escherichia coli ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay (thử nghiệm miễn dịch gắn enzym) EID50 Effective infectious dose 50 (Liều gây nhiễm hiệu quả 50%) ED50 Effective dose 50 (Liều gây miễn dịch 50%) FDA Food and Drug Administration (Cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc) HA Hemagglutination assay Thử nghiệm ngng kết hồng cầu HAU HA unit Đơn vị HA HI Hemagglutination inhibition ức chế ngng kết hồng cầu IVPI Intravenous Pathogenicity Index Chỉ số độ lực tiêm tĩnh mạch kD kiloDalton mARN message ARN ARN thông tin MDCK Madin-Darby Canine Kidney MDHQ Miễn dịch huỳnh quang MEM Minimum Essential Medium Môi trờng cần thiết tối thiểu ml mililit àg mcg MSV Master seed virus (Chủng gốc giống) M.tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Trực khuẩn Lao nm nanomet NMWL Nominal Molecular Weight Limit ( Kích cỡ giới hạn trọng lợng phân tử ) OD Optical Density Mật độ quang học PBS Phosphat Buffer Saline pfu Plaque Forming Unit (Đơn vị tạo đám hoại tử) PMKc Primary Monkey Kidney cells QC Quality Control Kiểm tra chất lợng RNP Ribonucleoprotein RT- PCR Reverse transcription- Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymeraza phiên mã ngợc) rpm round per minute (Vòng/phút) RV Realase Virus Virut giải phóng rg Reverse genetics Di truyền ngợc SIV Simian Immunodefficiency Virus Virut gây suy giảm miễn dịch ở khỉ SV40 Simian Virus 40 SFV Simian Foamy Virus Virut tạo bọt của khỉ SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (điện di trên gel polyacrylamid) SRID Single Radial Immuno Diffusion Khuyếch tán miễn dịch vòng tròn đơn SPF Specific Pathogen Free Không có các yếu tố gây bệnh đặc biệt TCYTTG Tổ Chức Y Tế Thế Giới TB Tế bào VX Vắcxin VABIOTECH Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1 WSV Working seed virus ( Chủng sản xuất) WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới mục lục Đặt vấn đề 1 Phần 1 : tổng quan 3 1.1. Đặc điểm chung của virút cúm 3 1.2.Cấu trúc virion 3 1.3. Cấu trúc hệ gen virút Cúm và các protein mã hóa 4 1.4. Sự tái tổ hợp của virút Cúm 8 1.5. Sự phát triển của virút trên tế bào 9 1.6. Sinh bệnh học 9 1.7. Chẩn đoán virút Cúm 10 1.8. Đặc điểm dịch tễ học 10 1.9. Kỹ thuật di truyền ngợc 13 1.10. Dự phòng 15 1.11. Một số quy trình sản xuất vắcxin Cúm 19 Phần 2: vật liệu và phơng pháp 21 2.1. Vật liệu 21 2.1.1 Tế bào 21 2.1.2. Virút 21 2.1.3 Kháng nguyên chuẩn A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) 22 2.1.4. ADN plasmit 22 2.1.5. Vật liệu và trang thiết bị khác 23 2.2. Phơng pháp 23 2. 2.1. Phơng pháp tạo virut tái tổ hợp 23 2.2.2. Sản xuất chủng giống gôc và chủng sản xuất vắcxin H5N1 23 2.2.3. Thử nghiệm kiểm tra độc lực của WSV rgA/H5N1 24 2.2.4. Quy trình lựa chọn khỉ sạch 24 2.2.5. Quy trình sản xuất vắc xin Cúm H5N1 trên quy mô phòng thí nghiệm 25 2.2.6. Phơng pháp định lợng HA trong vắcxin 27 2.2.7. Phơng pháp sản xuất kháng huyết thanh khỉ kháng H5N1 sử dụng trong thử nghiệm SRID 28 2.2.8. Các thử nghiệm huyết thanh học 28 2.2.9. Các thử nghiệm xác định hiệu giá virút 28 2.2.10. Các thử nghiệm kiểm tra chất lợng 29 2.2.11. Đánh giá sự nhân lên của virút trong quá trình nuôi cấy 34 2.2.12. Đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch trong thử nghiệm tiền lâm sàng 34 2.2.13. Phơng pháp thích ứng chủng NIBRG-14 trên tế bào PMKc và Vero 35 2.2.14. Phơng pháp thích ứng chủng rgA/H5N1 trên tế bào Vero 35 Phần 3: Kết quả 35 3.1. Thiết lập hệ chủng gốc và chủng sản xuất vắc xin Cúm rgA/ H5N1 với đầy đủ các chỉ tiêu kỹ thuật theo quy định 36 3.2. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắc xin Cúm rgA/H5N1 trên tế bào PMKc 43 3.3. Kết quả sản xuất thử nghiệm vắc xin Cúm ở quy mô phòng thí nghiệm 48 3.4. Kiểm tra chất lợng và đánh giá đáp ứng miễn dịch của vắcxin Cúm rgA/H5N1 trên động vật thực nghiệm 50 3.5. Kết quả nghiên cứu thích ứng chủng NIBRG-14 trên dòng tế bào PMKc, Vero và rgA/H5N1 trên Vero 59 3.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin cúm A/H5N1 về các mặt 64 KÕt luËn 70 KiÕn nghÞ 72 Tµi liÖu tham kh¶o 73 Danh mục các bảng trong báo cáo Bảng Tên bảng Trang Bảng 1 Các đoạn ARN trong hệ gen virút Cúm A và các protein mã hóa 5 Bảng 2 Các vắcxin Cúm đã đợc đăng ký sử dụng trên thế giới 16 Bảng 3 Hiệu giá virút rg 15T qua các lần cấy truyền 37 Bảng 4 Kết quả thử nghiệm kiểm tra độc tính của các chủng virút A/VN/1203,PR8 và rgA/H5N1 trên chồn sơng 39 Bảng 5 Kết quả phân tích tính kháng nguyên bằng phơng pháp HI của các chủng vắcxin và chủng bố mẹ 39 Bảng 6 Kết quả so sánh chủng rgA/H5N1 với chủng NIBRG -14 (WHO) 40 Bảng 7 Các phơng pháp kiểm tra khỉ sạch 44 Bảng 8 Quy trình kiểm tra khỉ sạch 45 Bảng 9 Kết quả nghiên cứu xác định quy trình gây nhiễm 45 Bảng 10 Kết quả nghiên cứu xác định hàm lợng nhôm hấp phụ tối u 48 Bảng 11 Kết quả kiểm tra trong quá trình sản xuất 49 Bảng 12 Kết quả hiệu giá kháng thể HI của khỉ sau khi tiêm 50 Bảng 13 Tơng quan giữa nồng độ huyết thanh khỉ và hàm lợng HA trong vắcxin Cúm bằng thử nghiệm SRID 51 Bảng 14 Hàm lợng HA trong các loạt vắcxin đợc định lợng theo phơng pháp SRID 52 Bảng 15 Kết quả các thử nghiệm kiểm tra về mặt sinh học 53 [...]... loạt vắcxin Cúm 67 Hình 17 Hàm lợng Thimerosal (g%) trong 15 loạt vắcxin Cúm 68 Hình 18 hàm lợng Al+++ (g%) trong 15 loạt vắcxin Cúm 68 Bài tóm tắt Đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm A/ H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm 1 Mục tiêu chính c a đề tài: 1.1 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm A/ H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy. .. (bán thành phẩm): HA 15àg/ml 4 Kết luận 1 Xây dựng đợc quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm A/ H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở qui mô phòng thí nghiệm đảm bảo tính ổn định và cho hiệu suất cao 2 Các loạt vắcxin Cúm A/ H5N1 sản xuất quy mô phòng thí nghiệm đã chứng minh đợc tính an toàn và hiệu quả gây miễn dịch trên thử nghiệm tiền lâm sàng Thử nghiệm tiêm các liều khác nhau trên khỉ cho thấy đáp... chủng cúm A/ H5N1 giảm độc lực dùng cho sản xuất vắcxin từ chủng virút H5N1 có độc tính cao (A/ Vietnam/1194/2004) với sự giúp đỡ và hợp tác c a Khoa Virút- Viện Y khoa- Đại học Tokyo- Nhật Bản, dới sự chỉ đạo c a giáo s Yoshihiro Kawaoka Nghiên cứu này đợc tiến hành với 2 mục tiêu chính: 1 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm A/ H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm. .. công nghệ sản xuất vắcxin Cúm A/ H5N1 trên tế bào PMKc Đã xây dựng đợc quy trình sản xuất đảm bảo chất lợng, ổn định với các thông số kỹ thuật phù hợp trong quy mô phòng thí nghiệm Quy trình sản xuất vắcxin Cúm A/ H5N1 quy mô phòng thí nghiệm Chủng gốc giống Chủng sản xuất vắcxin Gây nhiễm trên tế bào thận khỉ tiên phát 1 lớp Nuôi cấy 3 ngày, 37 oC 1oC Gặt -70 1oC (đông tan 3 lần) Ly tâm 5000 rpm,... đạt yêu cầu sau 2 mũi tiêm với liều tiêm từ 7,5àg/ml trở lên với hiệu giá HAI 1/40 5 Những đóng góp mới c a đề tài Đề tài đã xây dựng quy trình công nghệ và sản xuất thành công vắc xin Cúm A/ H5N1 trên tế bào ở quy mô phòng thí nghiệm Đây là một thành công có ý ngh a to lớn đối với cả trong và ngoài nớc Vắcxin Cúm A/ H5N1 thử nghiệm thành công trên thực đ a lâm sàng sẽ đem lại khả năng phòng chống đại... lan truyền khác nhau 1.5 Sự phát triển c a virút trên tế bào Virút cúm đầu tiên đợc nuôi trên trứng gà có phôi Sau này, các virút cúm có thể đợc nuôi cấy trên trứng gà có phôi hoặc trong một số hệ nuôi cấy tế bào tiên phát Việc nuôi cấy virút trên trứng gà có phôi vẫn đợc l a chọn làm quy trình sản xuất vắcxin cúm trên thế giới Hiện nay, các hệ nuôi cấy tế bào nh thận khỉ tiên phát hay thận chó Madin-Darby... rgA /H5N1 trên dòng tế bào Vero 64 Danh mục các hình trong báo cáo Hình Tên hình Trang Hình 1 Quy trình sản xuất vắc xin Cúm A/ H5N1 25 Hình 2 Trình tự nucleotit ở vị trí cắt liên quan đến độc tính c a virút trên đoạn gen HA c a virút rgA /H5N1 trong mỗi loạt vắcxin so với trình tự đó trên gen HA c a chủng virut hoang dại A/ VN/1194 36 Hình 3 Thân nhiệt c a chồn sau khi gây nhiễm với các chủng virút rgA /H5N1. .. chủng vắcxin rgA /H5N1 trên PMKc sau 72h 41 Hình 5 Hình ảnh tế bào PMKc sau gây nhiễm 72h chủng vắcxin rgA /H5N1 41 Hình 6 Hình ảnh tế bào PMKc sau khi gây nhiễm 72h với chủng vắcxin rgH5N1 42 Hình 7 Hình ảnh tế bào PMKc sau khi gây nhiễm 72h với chủng vắcxin rgA /H5N1 42 Hình 8 Hình ảnh tế bào PMKc sau khi gây nhiễm 72h với chủng vắcxin rgA /H5N1 43 Hình 9 Kết quả HA và OD280nm c a các phân đoạn sau khi... hoạt formalin 1:2000, 37 1oC, 96h Cô đặc, siêu lọc bằng Millipore Pellicon Cassette Pha bán thành phẩm cuối cùng Đóng ống Dán nhãn, đóng hộp 3.3 Kết quả sản xuất thử nghiệm vắcxin Cúm ở quy mô phòng thí nghiệm Sản xuất thử nghiệm vắcxin cúm bất hoạt H5N1 từ chủng dự tuyển này ở quy mô phòng thí nghiệm đợc thực hiện với 26 loạt liên tiếp để đánh giá tính ổn định c a quy trình và chia làm 2 giai đoạn:... kịp thời cho vụ dịch cúm mới Hiện nay trên thế giới cũng đã rất nhiều nớc nh Mỹ (Chiron), Pháp (Aventis), Nhật Bản ,Trung Quốc , Hungaria cũng đã có nhiều nỗ lực và sử dụng công nghệ di truyền ngợc để nghiên cứu phát triển một vcxin phòng cúm gia cầm H5N1 và cũng đang ở những giai đoạn khác nhau c a quá trình nghiên cứu Các hớng công nghệ đang đợc các nhà sản xuất l a chọn hiện nay bao gồm : 1/ Từ trứng . tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm A/H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm 1. Mục tiêu chính của đề tài: 1.1. Xây dựng quy trình công nghệ. tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm a/h5n1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm m số : ĐTĐL-2006/02G GS.TSKH.Nguyễn. Yoshihiro Kawaoka. Nghiên cứu này đợc tiến hành với 2 mục tiêu chính: 1. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vắcxin Cúm A/H5N1 trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô phòng thí nghiệm 2. Đánh