TÌM HIỂU VÀ PHÂN TÍCH PSEUDOMONAS AERUGINOSA

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC o0o BÀI TẬP LỚN HỌC PHẦN PHÂN TÍCH VI SINH TÊN ĐỀ TÀI TÌM HIỂU VỀ PSEUDOMONAS AERUGINOSA Lớp Học Phần 10DHTP1.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC -o0o BÀI TẬP LỚN: HỌC PHẦN PHÂN TÍCH VI SINH TÊN ĐỀ TÀI: TÌM HIỂU VỀ PSEUDOMONAS AERUGINOSA Lớp Học Phần: 10DHTP12 Mã Học Phần: 0101003652 Giảng viên: Nguyễn Thành Ln Nhóm: Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 25, tháng năm 2021 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -o0o TÊN ĐỀ TÀI: TÌM HIỂU VỀ PSEUDOMONAS AERUGINOSA Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 25, tháng năm 2021 PHIẾU GIAO NHIỆM VỤ Trang đính kèm phiếu giao nhiệm vụ GVHD ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Tổng quan Pseudomonas aeruginosa 1.1 Hình thái, cấu tạo 1.2 Cấu trúc tế bào 1.3 Phân bố .3 1.4 Đặc điểm nuôi cấy 1.5 Cấu trúc kháng nguyên .4 1.6 Độc lực .4 1.7 Sinh bệnh học CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA I PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC ĐỊNH LƯỢNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG NƯỚC – TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP Phương pháp định lượng ? Mục địch .7 Nguyên liệu nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 3.3 Trang thiết bị, dụng cụ, môi trường .8 Phương pháp nghiên cứu 10 4.1 Thiết kế nghiên cứu 10 4.2 Hóa chủng chuẩn 10 4.3 Thu mẫu .10 4.4 Bảo quản vận chuyển 10 4.5 Lọc mẫu .11 4.6 Pha loãng mẫu 11 4.7 Ủ mẫu 11 4.8 Điếm khuẩn lạc 11 4.9 Các xác định để khẳng định kết 12 4.10 Phương pháp xử lý phân tích kết 13 4.11 Đánh giá kết .14 Kết xét nghiệm tiêu Pseudomonas aeruginosa mẫu nước 15 Nhận xét 20 Thảo luận, kiến nghị, so sánh phân tích 21 Tổng kết, kiến nghị 22 II PHƯƠNG PHÁP API 20NE 22 Tổng quan 22 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, thuốc thử 22 2.1 Thiết bị .22 2.2 Dụng cụ 22 2.3 Hóa chất, thuốc thử .22 Cách tiến hành 23 Bổ sung thêm thuốc thử đọc kết 23 Kết 25 Nhận xét 26 Kết nghiên cứu 27 Thảo luận, kiến nghị 27 III PHÂN LẬP CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA SINH HOẠT CHẤT KHÁNG KHUẨN PYOCYANIN 27 Tổng quan phương pháp nghiên cứu 27 1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn 27 1.2 Phương pháp PCR 28 1.3 Phương pháp định danh API theo Kit 20NE 28 1.4 Phương pháp tách học (Ly tâm) 28 Nguyên liệu 29 Cách thực phương pháp .29 3.1 Phân lập vi khuẩn 29 3.2 Xác định gen đặc trưng cho loài Pseudomonas aeruginosa 29 3.3 Định danh vi khuẩn (theo Kit 20NE cho vi khuẩn Gram) .30 3.4 Phương pháp tách xác định hàm lượng PYO (Essar, 1990) 30 Kết nghiên cứu 30 4.1 Phân lập vi khuẩn đặc điểm hình thái PYO chủng Pseudomonas 30 4.2 Kết PCR đoạn gen đặc trưng cho loài Pseudomonas aeruginosa 31 4.3 Đặc điểm sinh hóa chủng phân lập 31 4.4 Chiết xuất định lượng thành phần hiệu pyocyanin .32 4.5 Khả kháng khuẩn pyocyanin chủng Pseudomonas sp PS39 32 Kết luận đóng góp trình nghiên cứu 33 Nhận định, kiến nghị 33 IV PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PSEUDOMONAS SP CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM GÂY BỆNH HÉO XANH Ở CÂY CÀ CHUA 34 Tổng quan 34 Nghiên cứu phương pháp 35 2.1 Đối tượng nghiên cứu 35 2.2 Phương pháp nghiên cứu .35 Kết thảo luận 36 3.1 Phân lập Pseudomonas sp từ đất trồng cà chua .36 3.2 Khả đối kháng Pseudomonas sp Ralstonia solanacearum37 3.3 Định danh chủng vi khuẩn chọn .39 Kết 41 Kết nghiên cứu cơng trình 41 V ĐỊNH DANH CHỦNG ĐỐI KHÁNG CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG HÀNH TÍM 42 Tổng quan phương pháp 42 1.1 Phương pháp phận lập, nuôi cấy vi khuẩn .42 1.2 Phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA .42 1.3 Phân tích phương sai - ANOVA phần mềm SPSS20 42 Phương pháp phân lập định danh chủng vi sinh vật chống lại bệnh thối củ hành tím vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa .42 Phương pháp phân lập vi khuẩn đất trồng hành tím 43 3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn đất hành tím 43 3.2 Khảo sát mức độ đối kháng vi khuẩn phân lập đất Pseudomonas aeruginosa đĩa thạch .43 3.3 Khảo sát khả chống lại bệnh thối củ hành tím vi khuẩn đối kháng nhà lưới .44 Định danh chủng đối kháng .44 Xử lý số liệu .44 Kết .44 6.1 Khả đối kháng huyền phù dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn phân lập từ đất 44 6.2 Hiệu giảm bệnh chủng vi khuẩn đối kháng điều kiện nhà lưới 45 6.3 Định danh vi khuẩn đối kháng 46 Thảo luận 47 Kết luận 48 Thảo luận, kiến nghị 48 DANH MỤC BẢNG Bảng 4.11 Yêu cầu tiêu P aeruginosa mẫu nước .14 (Theo QCVN – 1:2010/BYT) 14 Bảng 5.1 Kết xét nghiệm tiêu P aeruginosa mẫu nước bình uống liền phương pháp lọc màng 15 Bảng 4: Đọc kết phản ứng sinh hóa kít API 20NE .24 Bảng 5.2: Kết test thử sinh hóa API 20NE số chủng vi khuẩn phân lập mẫu nghiên cứu sau 24h nuôi cấy 26 Bảng 3.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập 37 Bảng 3.2.2 Hoạt lực đối kháng chủng vi khuẩn phân lập Ralstonia solanacearum sau 72 39 Bảng 3.1.Đặc tính chủng Pseudomonas P04 40 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Trực khuẩn mủ xanh Hình 1.7 Nhiễm trùng bệnh viện Hình 5.2: Kiểm tra phát huỳnh quang P aeruginosa đèn UV 19 Hình 5.3 Vi khuẩn P aeruginosa phân lập mẫu nước kính hiển vi quang học (1.000 X) 20 Hình 5.4 Số lượng mẫu phân tích số mẫu nhiễm vi khuẩn .20 Hình 5.5 Kết đánh giá chất lượng mẫu nước xét nghiệm tiêu P aeruginosa 21 Hình 5.1 Test API 20NE xác định tính chất sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu xét nghiệm ( mẫu 15, mẫu 46 ) .26 Hình 6.1 Test phản ứng oxidase ( chủng phân lập từ mẫu 16 ) 28 Hình 3.1.2 Hình dạng khuẩn lạc chủng vi khuẩn P01, P02, P03, P04 P05 39 Hình 3.2.1 Hoạt lực đối kháng chủng vi khuẩn phân lập Ralstonia solanacearum 39 Hình 3.2.3 Hoạt lực đối kháng mạnh chủng vi khuẩn P04 Ralstonia solanacearum 40 Hình 3.3.2 Kết giải trình tự vùng gen 16S-rRNA chủng P04 41 Hình 3.3.3 Kết so sánh tương đồng chủng P04 Pseudomonas aeruginosa DSM 50071 42 Hình Chủng vi khuẩn 3B đặc tính, sinh lý sinh hóa 48 Hình 2.Chủng vi khuẩn 4A đặc tính, sinh lý sinh hóa 48 ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội ngày phát triển nhu cầu chăm sóc bảo vệ sức khoẻ người ngày cao; người làm nhiều cải vật chất, nâng cao chất lượng sống có sức khỏe tốt Tồn xung quanh có nhiều tác nhân gây bệnh mà mắt thường khơng thể nhìn thấy được, có vi sinh vật gây bệnh nguy hiểm Khi thể suy yếu, sức đề kháng giảm hội để chúng công Hiện nay, với phát triển mạnh mẽ không ngừng nghĩ khoa học y học, người ta phân lập, phát nhiều loại vi khuẩn có khả gây bệnh; đặc biệt loại vi khuẩn gây nhiễm trùng hội Pseudomonas aeruginosa ( hay gọi Trực khuẩn mủ xanh ) - tác nhân quan trọng gây nhiễm khuẩn bệnh viện nguy hiểm Pseudomonas aeruginosa gây nhiều ca nhiễm trùng hầu hết bệnh viện, gây nhiều loại nhiễm trùng khác cho người nhiễm trùng đường ruột, nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm phổi, công vào vết thương, vết mổ người bệnh gây tình trạng nhiễm trùng huyết nặng Nó nguyên nhân thường xuyên bệnh nhiễm trùng phức tạp đe dọa tính mạng người Vì vậy, việc tìm hiểu, nghiên cứu tác nhân gây bệnh cách chữa trị cho người việc làm thiết thực có ý nghĩa vơ quan trọng, góp phần vào phát triển chung tồn nhân loại CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TỔNG QUAN PSEUDOMONAS AERUGINOSA 1.1 Hình thái, cấu tạo Pseudomonas aeruginosa trực khuẩn gram âm hiếu khí, có dạng hình que nhỏ, đứng hay thành đơi kết hợp thành chuỗi ngắn, hai đầu tròn, thẳng cong không xoắn, dài khoảng - 5μm, rộng 0,5 - 1μm Trực khuẩn mủ xanh khơng sinh bào tử, có khả di động nhờ tiên mao đơn cực, dinh dưỡng linh hoạt đáng kinh ngạc Hình Trực khuẩn mủ xanh 1.2 Cấu trúc tế bào Vỏ polysaccaride: P aeruginosa tiết chất nhầy có cấu tạo polysaccharide gồm nhiều tiểu phần mannuronic acid glucuronic acid hay gọi alginate Để bảo vệ che chở vi khuẩn tồn môi trường tự nhiên tránh hệ miễn dịch thể vật chủ dạng alginate kết hợp với tạo thành dạng cấu trúc biofilm Màng sinh chất: Hầu hết chủng P aeruginosa có khả tổng hợp loại protein bề mặt gắn màng sinh chất (Protein F) vận chuyển có chọn lọc chất qua lại màng giới hạn khoảng 500 Da Nó giúp ngăn khơng cho chất có hại vào bên tế bào giúp cho P aeruginosa có khả đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh giảm tính thấm màng Tiên mao tiêm mao: P aeruginosa có tiên mao (flagella) cực, tiên mao giúp cho vi khuẩn di động Tiên mao cấu tạo protein gọi flagellin Các flagellin mang tính chất kháng nguyên, gọi kháng nguyên lông H Tiêm mao (pili): sợi lông mảnh, mọc quanh bề mặt tế bào dài khoảng nm Tiêm mao giúp vi khuẩn bám vào bề mặt biểu mô tế bào vật chủ hay mơi trường lỏng q trình lây nhiễm Vật chất di truyền: Vật chất di truyền P.aeruginosa phân tử DNA trần, dạng vòng tồn nguyên sinh chất Kích thước DNA từ 5,2 - triệu cặp base chứa Hình 3.1.2 Hình dạng khuẩn lạc chủng vi khuẩn P01, P02, P03, P04 P05 3.2 Khả đối kháng Pseudomonas sp Ralstonia solanacearum Khả đối kháng chủng phân lập Ralstonia solanacearum đánh giá Kết đối kháng thể hình 3.2.1 bảng 3.2.2 Hình 3.2.1 Hoạt lực đối kháng chủng vi khuẩn phân lập Ralstonia solanacearum 42 Bảng 3.2.2 Hoạt lực đối kháng chủng vi khuẩn phân lập Ralstonia solanacearum sau 72 Kết cho thấy có chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum, xuất vịng vơ khuẩn với phạm vi đường kính 0,3 mm-1,5 cm Đặc biệt chủng P04 có khả gây đối kháng mạnh với R solanacearum, đường kính đối kháng 1,5-5 cm (Hình 3) Vì vi khuẩn dễ dàng phát triển, làm diện tích đối kháng lan rộng Hình 3.2.3 Hoạt lực đối kháng mạnh chủng vi khuẩn P04 Ralstonia solanacearum sau a) 24 giờ, b) 36 giờ, c) 48 d) 72 Theo nghiên cứu Lê Thị Thanh Thủy Lê Như Kiều, phân lập Pseudomonas aeruginosa đối kháng Ralstonia solanacearum với đường kính đối kháng 1,2 cm (Lê Thị Thanh Thủy, Lê Như Kiều, 2010) So với chủng P04 phân lập nghiên cứu này, P04 R solanacearum, mạnh chủng Pseudomonas hai tác giả nghiên cứu, đường kính 1,5 - cm sau 24-72h nuôi cấy 3.3 Định danh chủng vi khuẩn chọn: Các đặc điểm hình thái sinh hóa chủng P04 nghiên cứu, kết trình bày Bảng 3.3.1 43 Bảng 3.1.Đặc tính chủng Pseudomonas P04 Công nghệ sinh học phân tử sử dụng để giải trình tự đoạn gen 16S-rRNA chủng P04 định danh loài vi khuẩn Kết mẫu Công ty TNHH MYV Sinh Hố Phù Sa Đọc kết theo trình tự Nuclêôtit gen 16S-rRNA phân loại BLAST chủng P04 chủng P04 có trình tự vùng gen 16SrRNA (Hình 3.3.2) tương đồng lên đến 99,79% với lồi Pseudomonas aeruginosa (mã NR_117678.1, Hình 3.3.3) Điều cho phép kết luận chủng vi khuẩn P04 Pseudomonas aeruginosa Hình 3.3.2 Kết giải trình tự vùng gen 16S-rRNA chủng P04 44 Hình 3.3.3 Kết so sánh tương đồng chủng P04 Pseudomonas aeruginosa DSM 50071 Kết luận: Mẫu đất trồng củ cà chua gia đình P.Hịa Q, Q.Ngũ Hành Sơn, TP.Đà Nẵng phân lập chủng vi khuẩn có ký hiệu P01, P02, P03, P04 P05, chúng phát triển tốt mơi trường King's B bắt màu huỳnh quang quan sát tia cực tím Trong đó, chủng P04 có khả đối kháng mạnh với vi khuẩn Ralstonia solanacearum Chủng vi khuẩn P04 định danh Pseudomonas aeruginosa Kết nghiên cứu cơng trình : Kết nghiên cứu sở để đa dạng hóa chế phẩm sinh học, cải thiện ứng dụng chế phẩm Pseudomonas sp vào lĩnh vực nơng nghiệp phịng chữa bệnh héo xanh vi khuẩn Bệnh héo xanh vi khuẩn gây bệnh khó phịng trừ, bệnh không xuất cà chua mà cịn xuất loại có giá trị kinh tế cao khoai tây, ớt, vừng, lạc, đậu tương… Vấn đề phòng chống bệnh nhiều khó khăn phức tạp Tại nhiều hộ trồng cà chua, để hạn chế dịch bệnh lây lan, người dân thường thực biện pháp phòng trừ tồn diện, tích cực canh tác đất, chọn giống trồng vùng không nhiễm bệnh Tuy nhiên, phương pháp khơng mang lại hiệu cao phụ thuộc nhiều vào điều kiện ngoại cảnh Một phương pháp sử dụng để tiêu diệt bệnh héo xanh vi khuẩn sử dụng thuốc trừ sâu hóa học Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học cách chữa bệnh tạm thời cho diệt bệnh nhẹ, sau thời gian bệnh tái phát gây nhiễm trùng nặng Hơn nữa, sử dụng nhiều loại thuốc hóa học với liều lượng lớn thời gian dài làm cân quần thể vi sinh vật có ích đất, kìm 45 hãm phát triển vi sinh vật có ích, ngồi cịn tạo điều kiện cho vi sinh vật có hại, nấm bệnh hay côn trùng phát triển Mặt khác, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật sản phẩm đất gây ô nhiễm nguồn nước ngầm gây hại nghiêm trọng cho sức khỏe người động vật Vì vậy, phương pháp hóa học dần thay phương pháp sinh học, hướng phương pháp tăng cường sản xuất chế phẩm sinh học Có nhiều chủng vi khuẩn sử dụng làm chế phẩm (Phạm Văn Kim at el., 2010), có chủng Pseudomonas sp Chúng quan tâm nghiên cứu hàng đầu sở hữu khả tổng hợp số chất ngoại bào, kích thích phát triển rễ cây, tăng sức đề kháng, ức chế phát triển nhiều vi sinh vật gây bệnh (Santos et al., 2007; Chu Nguyên Thanh, Đào Ngọc Diệp, 2018; Mansoor et al., 2007) Xuất phát từ nhu cầu thực tế góp phần đa dạng hóa chế phẩm sinh học, cải tiến ứng dụng Pseudomonas sp vào lĩnh vực nơng nghiệp, nghiên cứu nhằm mục đích chọn dịng Pseudomonas sp có khả chống lại vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum cho cà chua, sử dụng để sản xuất chế phẩm phòng trị bệnh héo xanh vi khuẩn R solanacearum V ĐỊNH DANH CHỦNG ĐỐI KHÁNG CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG HÀNH TÍM Tổng quan phương pháp: 1.1 Phương pháp phân lập, nuối cấy vi khuẩn Việc phân lập vi khuẩnn giai đoạn quan trọng q trình nghiên cứu ni cấy vi khuẩn Phương pháp phân lập mục đích tách chủng vi khuẩn khỏi quần thể ban đầu tạo thành khiết để khảo sát định danh Sau nuôi cấy môi trường vi khuẩn phát triển hình thành khuẩn lạc, dựa hình thái khuẩn lạc mang đặc trưng loại vi khuẩn Việc chọn lọc xác chủng khuẩn lạc phân lập phần quan trọng việc định danh vi khuẩn học Trong q trình ni cấy vi khuẩn, việc quan trọng tránh để nguồn vi sinh vật lạ xâm nhập vào mơi trường [17] [18] 1.2 Phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA Giải trình tự gen 16S rRNA sau: - Trích xuất DNA gen - Khuếch đại PCR gen 16S rRNA - Thu trình tự nucleotide gen rRNA 16S khuếch đại - So sánh trình tự với trình tự nucleotide có sở liệu Do 16S rRNA cần thiết cho hoạt động vi khuẩn Trình tự 16S rRNA sử dụng rộng rãi việc xác định định danh phân loại chủng vi khuẩn Định danh xác loại vi khuẩn dựa trình tự nucleotide đặc trưng gen mã hóa cho 16S rRNA vi khuẩn kỹ thuật giải trình tự gen 1.3 Phân tích phương sai - ANOVA phần mềm SPSS20 Phân tích phương sai (Analysis of Variance) gọi kiểm định ANOVA kỹ thuật thống kê tham số sử dụng để so sánh liệu Phân tích ANOVA có chức đánh giá khác biệt tiềm biến phụ thuộc mức quy mô 46 biến mức danh nghĩa có từ loại trở lên Kỹ thuật kiểm định ANOVA phát triển Ronald Fisher năm 1918 Phương pháp phân lập định danh chủng vi sinh vật chống lại bệnh thối củ hành tím vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa: Đối tượng nghiên cứu: - Các chủng vi khuẩn đối kháng đất có khả phịng trị bệnh thối củ hành tím vi khuẩn P aeruginosa - Chủng vi khuẩn P aegurinosa cung cấp Nhóm Nghiên cứu Bệnh thuộc Phịng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ - Hành tím giống hành tím địa phương Chi cục Bảo vệ Thực vật tỉnh Sóc Trăng cung cấp Phương pháp phân lập vi khuẩn đất hành tím: Thu thập mẫu đất ruộng trồng củ hành tím không bị nhiễm bệnh vùng mẫu đất bị nhiễm bệnh Ở ruộng trồng, ta thu mẫu đất điểm có độ sâu từ - 20 cm theo đường chéo góc trộn bỏ vào túi nhựa Sử dụng 10g mẫu đất 90 mL nước cất vô trùng lắc 30 phút máy lắc ngang Sau pha lỗng dung dịch 1000 lần với nước cất vơ trùng trải 50 µL lên mơi trường trường nutrient agar (NA) [5 g peptone, g beef extract, g NaCl, 20 g agar, thêm nước cất vừa đủ 1.000 mL, pH 6,8] Sau nuôi cấy 48 giờ, chọn lọc khuẩn lạc vi khuẩn có hình thái khác nằm bề mặt môi trường nuitrient agar ròng Các chủng vi khuẩn bảo quản trọng dung dịch glycerol 15% để sử dụng cho việc ngiên cứu sau 3.1 Khảo sát mức độ đối kháng vi khuẩn phân lập đất Pseudomonas aeruginosa đĩa thạch Trải 50 µL huyền phù vi khuẩn P.aeruginosa (đươc nuôi cấy 48 giờ, với mật số 109 CFU/mL) lên đĩa môi trường NA Tiếp theo chấm sinh khối khuẩn lạc vi khuẩn phân lập (được nuôi cấy 48 đĩa thạch NA) lên đĩa NA điểm cách nhau, ủ nhiệt độ 28±2oC tủ ủ 48 Việc lặp lại lần đĩa khác cho chủng vi khuẩn phân lập khác Sau ủ, lựa chọn chủng vi khuẩn có khả đối kháng đo bán kính vịng vơ khuẩn Bảo quản chủng vi khuẩn có khả đối kháng để nghiên cúu thí nghiệm sau 3.2 Khảo sát khả ức chế vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa dịch nuôi cấy vi khuẩn đối kháng Sử dụng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa nuôi cấy đặt đĩa môi trường tạo giếng (đường kính mm) cách đối xứng ống đục vô trùng Đánh số giếng theo chiều kim đồng hồ từ - Các chủng vi khuẩn đối kháng nuôi cấy 10 mL môi trường nutrient broth (NB) Ở thời điểm 2, 4, ngày sau nuôi cấy, đem mL vi khuẩn dạng huyền phù ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút 15 phút để dịch ni cấy khơng cịn tế bào vi; lấy 20 µL dịch nuôi cấy 47 cho vào giếng 3; sau lấy 20 µL mơi trường NB cho vào giếng giếng cho 20 µL nước cất trùng ủ nhiệt độ 28±2 oC tủ ủ 48 Mỗi loại chủng vi khuẩn lặp lại lần đĩa khác Quan sát khả tạo vịng vơ khuẩn dịch ni cấy đo bán kính vịng vơ khuẩn 3.3 Khảo sát khả chống lại bệnh thối củ hành tím vi khuẩn đối kháng nhà lưới Thí nghiệm thực theo hoàn toàn ngẫu nhiên với lần lặp lại gồm nhân tố (1) chủng vi khuẩn đối kháng tuyển chọn nuôi cấy phần 1.1 1.2, (2) mật số vi khuẩn đối kháng (109, 108 107 CFU/mL) (3) phương pháp xử lý vi khuẩn đối kháng Nghiệm thức đối chứng âm xử lý với nước cất trùng nghiệm thức đối chứng dương xử lý với thuốc hóa học Starner 20WP 1% Đất phù sa trồng hành tím phơi khơ, băm nhỏ, xử lý phèn vôi bột Tiếp theo , trộn tỉ lệ 3:1:2 đất: trấu: cát theo khối lượng, Sử dụng chậu nhựa (25x17cm) cho hỗn hợp đất tưới nước làm mềm đất Củ hành tím giống tách lớp vỏ bên dùng ethanol 70%, ủ với trấu ẩm cho rễ trước đem trồng vào chậu (10 củ/chậu) Củ hành tím gieo bệnh cách tạo vết thương khoảng 5mm xung quanh cổ củ tiêm 500 µL huyền phù vi khuẩn P aegurinosa (mật số109 CFU/mL) thời điểm 30 ngày sau gieo trồng Tiến hành ghi nhận phần trăm mức độ nhiễm bệnh (tỉ lệ thể tích củ nhiễm bệnh/tổng thể tích củ củ hành) 4, 12 ngày sau chủng bệnh [19] Định danh vi khuẩn đối kháng: Vi khuẩn đối kháng định danh kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp với Hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey’s [20] Xử lý số liệu: Các số liệu thu thập phân tích phương sai ANOVA phần mềm SPSS 20, khác biệt nghiệm thức so sánh kiểm định Duncan độ tin cậy 95% Kết quả: 6.1 Khả đối kháng huyền phù dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn phân lập từ đất Hiện có tổng số 133 chủng phân lập từ bốn mẫu đất trồng hành tím Loại chủng vi khuẩn có hình dạng khuẩn lạc phổ biến trịn, rìa có khía khơng khía, màu trắng trắng đục, kích thước khơng đồng Trong chủng vi khuẩn phân lập, chủng vi khuẩn (2C, 3A, 3B 4A) sở hữu khả đối kháng cao với vi khuẩn P aeruginosa Chủng 3B có khả đối kháng cao (bán kính vịng vơ khuẩn = mm) Ở thí nghiệm khảo sát khả ức chế mầm bệnh thối củ dịch tế bào dịch nuôi cấy hai chủng 2C 4A có khả ức chế vi khuẩn P aeruginosa với bán kính vịng vơ khuẩn 5,6 mm 6,0 mm thời điểm sau 48 nuôi cấy Nhưng, khả ức chế mầm bệnh dịch nuôi cấy biến 48 sau ngày nuôi cấy Dựa vào kết kiểm nghiệm, có hai chủng vi khuẩn 3B 4A đạt điều kiện để khảo sát khả làm giảm bệnh thối củ điều kiện nhà lưới [21] 6.2 Hiệu giảm bệnh chủng vi khuẩn đối kháng điều kiện nhà lưới Kết khảo sát hiệu giảm bệnh thối củ hành tím vi khuẩn P aegurinosa hai chủng vi khuẩn 4A 3B điều kiện nhà lưới trình bày Bảng Trong đó, áo củ với chủng vi khuẩn 3B đạt hiệu giảm bệnh cao mật số 10 CFU/mL Trong tất kiểm nghiệm chủng vi khuẩn phương pháp áo củ, hiệu giảm bệnh kéo dài đến thời điểm 12 NSCB riêng nghiệm thức áo củ với chủng vi khuẩn 4A mật số 107 CFU/mL cho hiệu giảm bệnh thời điểm NSCB Còn phương pháp chủng vi khuẩn đối kháng vào đất, kết nghiệm thức với chủng vi khuẩn 3B mật số 109 CFU/mL cho hiệu giảm bệnh cao đến 12 NSCB với mức độ bệnh thối củ 49,33% Mặc dù nghiệm thức mức độ bệnh cao so với nghiệm thức đối chứng dương (1,67%), thấp khác biệt ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng âm (98,33%) Theo số tiêu chí đề gồm hiệu giảm bệnh cao kéo dài với mật số huyền phù vi khuẩn thấp, nghiệm thức áo củ với chủng 4A 3B mật số 10 CFU/mL chủng vào đất với 4A mật số 108 CFU/mL 3B mật số 109 CFU/mL có tiềm cao tuyển chọn để nghiên cứu khả phịng trị bệnh thối củ hành tím vi khuẩn P aegurinosa điều kiện ruộng đất Các số có giá trị trung bình thời điểm khảo sát theo sau chữ giống khác biệt khơng ý nghĩa mức mức 5% phép thử Duncan NSCB: ngày sau chủng bệnh 6.3 Định danh vi khuẩn đối kháng Trình tự mã gen 16S rRNA chủng vi khuẩn 4A 3B so sánh với trình tự gen 16S rRNA chủng vi khuẩn khác sở liệu GenBank (NCBI) Sau khảo sát trình tự gen chủng 3B có độ tương đồng 99% với trình tự gen lồi chi Bacillus trình tự gen chủng 4A có độ tương đồng 99% với trình tự gen loài vi khuẩn chi Bacillus Vì giống độ tương, hai chủng vi khuẩn tiếp tục kiểm nghiệm đặc điểm sinh lý sinh hóa để xác định tên lồi 49 Chủng vi khuẩn 3B Chủng vi khuẩn 4A Bacillus aerius (KY818962.1) B.aerophilus (KC172020.1) B altitudinis (KC172026.1) B pumilus (KY621522.1) B safensis (KR063199.1) B stratosphericus (KC172037.1) B subtilis (JQ039972.1) B aerius (KR708841.1) B aerophilus (KY124216.1) B altitudinis (KU955326.1) B pumilus (KU962124.1) B stratosphericus (KT986099.1) Chủng vi khuẩn 3B vi khuẩn Gram dương, dạng hình que (Hình 1A),vi sinh vật hiếu khí (phát triển bề mặt mơi trường thạch), có khả sinh nội bào tử (Hình 1B) di động (Hình 1C), tổng hợp enzyme catalase (Hình 1D), khả sinh trưởng nhiệt độ 45o C (Hình 1E) khơng có khả phân giải tinh bột (Hình 1F) Nên, chủng 3B xác định vi khuẩn B safensis Hình Chủng vi khuẩn 3B đặc tính, sinh lý sinh hóa A: Gram dương; B: Sinh nội bào tử; C: Di động (+); D: Tổng hợp enzyme catalase (+); E: Phát triển 45oC (+); F: Khơng phân giải tinh bột (-) Cịn chủng vi khuẩn 4A vi khuẩn Gram dương, dạng hình que (Hình 2A), vi sinh vật hiếu khí (sinh trưởng bề mặt mơi trường thạch), có khả sinh nội bào tử (Hình 2B) di động (Hình 2D), tổng hợp enzyme catalase (Hình 2C), khơng thể phát triển nhiệt độ 45o C (Hình 2E), mẫn cảm với kháng sinh ampicillin (Hình 1F) khơng mẫn cảm với lincomycin (Hình 2G) Nên, chủng 4A xác định vi khuẩn B stratosphericus 50 Hình 2.Chủng vi khuẩn 4A đặc tính, sinh lý sinh hóa A: Gram dương; B: Sinh nội bào tử; C: Tổng hợp enzyme catalase (+); D: Di động (+); E: Không phát triển nhiệt độ 45oC (-); F: Mẫn cảm với ampicillin (+); G: Không mẫn cảm với lincomycin (-) Thảo luận: Kết nghiên cứu , có hai chủng vi khuẩn 4A 3B định danh phương pháp giải trình tự 16S rRNA, điểm hạn chế kỹ thuật phân biệt chủng vi khuẩn phân nhóm chúng có độ tương đồng cao giống trình tự gen 16S rRNA Xét thấy trình tự gen 16S rRNA chủng 3B 4A cho thấy hai độ tương đồng (99%) với 12 loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus Nhưng ta khơng thể xác định tên lồi chủng 3B 4A dựa vào độ tương đồng Ngoài ra, sử dụng độ tương đồng cao để định danh chủng vi khuẩn thể kết khơng xác khơng đáng tin cậy gen 16S rRNA chiếm phần nhỏ gen vi sinh vật Nên, bổ sung kiểm nghiệm dựa khác đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn vào phương pháp định danh điều cần thiết, đạt kết định danh xác đáng tin cậy Bằng cách kết hợp phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA với kiểm nghiệm sinh lý, sinh hóa theo Hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey’s, chủng 3B định danh vi khuẩn B safensis chủng 4A vi khuẩn B stratosphericus Vi khuẩn B safensis coi tác nhân phịng trừ sinh học hữu ích canh tác nông nghiệp theo hướng bền vững Hiện nay, chưa có báo cáo nói khả gây hại đến môi trường, người, động vật trồng hai lồi vi khuẩn Vì vậy, hai chủng vi khuẩn B stratosphericus 4A B safensis 3B có tiềm ứng dụng phịng trừ sinh học bệnh thối củ hành tím điều kiện ngồi đồng Kết luận: Ta có chủng vi khuẩn (2C, 3A, 3B 4A) có khả đối kháng với vi khuẩn P aeruginosa đĩa thạch, chủng 3B có khả đối kháng mạnh (bán kính vịng vơ khuẩn = mm) Cịn dịch ni cấy chủng 4A đạt hiệu ức chế cao (bán kính vịng vơ khuẩn = mm) Trong điều kiện nhà lưới, áo củ với chủng 4A 3B (ở mật độ 108 CFU/mL) chủng đất với chủng 4A (10 CFU/mL) chủng 3B (109 CFU/mL) cho kết giảm bệnh cao kéo dài đến điểm 12 NSCB Phương 51 pháp định danh phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp với khảo sát đặc điểm hình thái sinh hóa có kết vi khuẩn chủng 3B B safensis chủng 4A B stratosphericus Kết đóng góp phương pháp nghiên cứu Xác định chủng vi khuẩn đối kháng có khả chống lại thối củ hành tím vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa định danh kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp với hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey’s vi khuẩn B safensis chủng 4A vi khuẩn B stratosphericus Phương pháp nghiên cứu đóng góp nên tảng sở xác định chủng loại vi khuẩn có khả chống lại bệnh tật giống trồng nông nghiệp Thảo luận kiến nghị: Bệnh thối củ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa gây bệnh gây thiệt hại suất chất lượng hành tím Việc phịng chống bệnh việc sử dụng thuốc hóa học biện pháp phổ biến để phòng trị bệnh thối củ hành tím Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người, gây nhiễm mơi trường, tăng chi phí sản xuất có khả trị bệnh giai đoạn bệnh phát triển, đồng thời làm tăng khả kháng thuốc mầm bệnh Phòng trừ sinh học bệnh vi khuẩn đối kháng với mầm bệnh xem biện pháp hiệu bền vững, thân thiện với mơi trường an tồn cho sức khỏe người Bên cạnh, khả đối kháng trực tiếp với mầm bệnh, vi khuẩn đối kháng cịn có khả nhân mật số nhanh, kích thích sinh trưởng tính kháng bệnh trồng, sử dụng vi khuẩn đối kháng đất có nguồn gốc địa hướng phòng trừ bệnh tiềm cho kết cao phòng trị bệnh nhiều loại trồng Nghiên cứu nhằm phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn đối kháng đất có khả phịng trị bệnh thối củ hành tím vi khuẩn P aeruginosa gây đạt kết định danh phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp với khảo sát đặc điểm hình thái sinh hóa vi khuẩn cho thấy chủng 3B Bacillus safensis chủng 4A Bacillus stratosphericus Giải trình tự gen 16S rRNA coi tiêu chuẩn vàng để xác định vi khuẩn Trình tự so sánh gen 16S ribosome RNA (rRNA) vi khuẩn chứng minh phương pháp xác tái tạo để xác định sinh vật chưa biết Hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey’s có ưu điểm giúp cho phương pháp nghiên cứu dễ dàng để xác định chủng vi khuẩn cách sử dụng tính chất đặc tính sinh ly, sinh hóa (hình dạng, nội bào tử, nhuộm Gram, vận động, thuộc tính enzyme khác nhau) loại thơng tin khác phục vụ để phân định sinh vật nhóm sinh vật Để phát triển biện pháp phịng trừ sinh học để chống lại bệnh hại trồng ngành nông nghiệp ứng dụng phương pháp định danh phân lập kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp với hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey’s để tìm chủng loại vi khuẩn mang khả chống lại bệnh thối củ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa hành tím sử dụng loại vi khuẩn đối 52 kháng có đất ni trồng để tạo chế phẩm sinh học nhằm phòng trừ bệnh thối củ hành tím vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] Các yêu cầu chung lực phòng thử nghiệm hiệu chuẩn., 2005 I 5.-3 : TCVN 6663-3:2008, "Chất lượng nước lấy mẫu," in Phần 3: Hướng dẫn bảo quản xử lý mẫu Chất lượng nước lấy mẫu- Phần Hướng dẫn vào bảo quản xử lý mẫu, 2003 Chất lượng nước phát đếm Escherichia coli Coliforms: Phần1: PP lọc màng, 2009 T 6.-1 I 9308-1:2000, "Chất lượng nước phát hiên đếm Escherichia coli Coliform" Chất lượng nước, phát đếm Pseudomonas Aeruginosa - Phương pháp màng lọc, 2011 B Y Tế, "Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia nước khống thiên nhiên nước uống đóng chai," 2010 Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia nước khống thiên nhiên nước uống đóng chai, 2010 P T O Oanh, "Đánh giá trình trạng nhiễm khuẩn Pseudomonas Aeruginosa nước uống bình," Học viện khoa học công nghệ, 2019 N V Oai, "Thực trạng, nguyên nhân nhiễm Pseudomonas aeruginosa nước uống đóng chai giải pháp hạn chế," Bản tin khoa học đời sống, p số /2014, 2014 "SCB SCIENTIFIC," [Online] Available: https://hoachatthinghiem.org/product/api20ne-bo-thuoc-thu-api/? fbclid=IwAR39mYu4tj_9ZeVoEkJwkmFk4kiBrk5WRg9eAibwHmZNNRABNbJpOW _5ch0 "QUY TRÌNH KỸ THUẬT LÀM GIÁ ĐƯỜNG 20NE," [Online] Available: http://benhviendktinhquangninh.vn/quy-trinh-ky-thuat-xet-nghiem-visinh/vsqtktnc13quy-trinh-ky-thuat-lam-gia-duong-20ne.3804.html? fbclid=IwAR3i70YS4u8d9haoI49403y959r9JwZ6HZO-YdYnUxwjG13eRcOS5emma4 C L B W P N Favero MS, "Pseudomonas aeruginosa: growth in distilled water from hospitals," Science,, pp 173(999), pp 836-844, 1971 Q V Nguyễn, Phân lập chủng Pseudomonas aeruginosa sinh hợp chất kháng khuẩn Pyocyanin, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (VAST) Đ T D Nguyễn Tất Thắng, " Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Raltonia solanacearum Smith ) hại khoai tây vùng Hà Nội, phụ cận biện pháp phịng trừ.," Tạp chí Khoa học Phát triển 9(5): 725-734., 2011 L N K ( Lê Thị Thanh Thủy, " Phân lập tuyển chọn vi khuẩn đối kháng Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh lạc vừng.," Tạp chí Khoa học Công nghệ 48(3): 33-42 N Đ Q v P V T Nguyễn Lân Dũng, "Vi sinh vật học," Nhà xuất Giáo Dục Hà Nội,, p 520 trang, 2007 N T Hà, "Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật y học," Nhà xuất Y học Hà Nội, pp trang 329-338, 1991 N T Học, " Phân lập xác định mầm bệnh phổ biến hành tím (Allium ascalonicum) thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng.," Luận văn Cao học Trường Đại học Cần Thơ Thành phố Cần Thơ , 2016 P L S T J T H a Y K Woo, " Then and now: Use of 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology 54 laboratories.," Clinical Microbiology and Infection, p 14, 2008 [21] S K R S A a A D Yadav, " Genetic and functional diversity of Bacillus strains in the soils longterm irrigated with paper and pulp mill effluent," The Journal of General and Applied Microbiology, p 57(4): 183–195, 2011 55 ... Phương pháp xử lý phân tích kết 13 4.11 Đánh giá kết .14 Kết xét nghiệm tiêu Pseudomonas aeruginosa mẫu nước 15 Nhận xét 20 Thảo luận, kiến nghị, so sánh phân tích 21... 1.3 Phân tích phương sai - ANOVA phần mềm SPSS20 42 Phương pháp phân lập định danh chủng vi sinh vật chống lại bệnh thối củ hành tím vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa .42 Phương pháp phân. .. LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA Để nghiên cứu cặn kẽ chủng Pseudomonas Aeruginosa nhóm qua phương pháp nghiên cứu sau : - Phương pháp màng lọc định lượng Pseudomonas