BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM oOo BỘ MÔN PHÂN TÍCH VI SINH Báo cáo tiểu luận PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VIBRIO CLOLERA Tp Hồ Chí Minh, T.
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM oOo BỘ MƠN PHÂN TÍCH VI SINH Báo cáo tiểu luận PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA VI SINH VIBRIO CLOLERA Mục Lụ Tp.Hồ Chí Minh, Tháng năm 2021 Mục Lục .2 Phụ lục hình ảnh .4 Phụ Lục Bảng LỜI CẢM ƠN LỜI MỞ ĐẦU I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan 1.2 Tầm quan trọng việc nghiên cứu Vibro cholerae .3 1.3 Một số kỹ thuật dùng để phân tích Vibrio cholerae: II Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.1 Vật liệu phương pháp 2.1.1 Các chủng vi khuẩn 2.1.2 Chuẩn bị AND 2.1.3 Mồi PCR 2.1.4 Giao thức PCR 2.2 Kết .9 III Kỹ thuật ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) IV Các Phương pháp .10 4.1 Phương pháp định tính: 10 4.1.1 Phạm vi áp dụng: .10 4.1.2 Nguyên tắc: .10 4.1.3 Môi trường hóa chất 10 4.1.4 Các bước tiến hành 11 4.1.5 Quy trình phân tích: 12 4.2 Phương pháp nuôi cấy phân lập .15 4.2.1 Phạm vi áp dụng: 15 4.2.2 Phương pháp tiến hành: 15 4.2.3 Đọc kết quả: 16 V Phân tích phương pháp .16 5.1 Phương pháp Elisa 16 5.2 Phương pháp PCR: 17 5.3 Phương pháp nuôi cấy phân lập: 18 VI So sánh qui trình theo TCVN ISO .18 Tài liệu tham khảo 20 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH Hình Vibrio cholerae .3 Hình Khuẩn lạc Vibrio cholerae mơi trường Thiosulohate Citrate Bile salt Sucrose 16 PHỤ LỤC BẢNG Bảng Môi trường hóa chất phương pháp định tính 11 Bảng Một số ứng dụng PCR phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm Việt Nam (PTN Công nghệ sinh học phân tử, trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM) 17 Bảng Tiêu chuẩn TCVN ISO phương pháp 18 Bảng So sánh ưu nhược điểm phương pháp PCR Elisa 19 LỜI CẢM ƠN Lời chúng em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến thầy cô trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM giúp chúng em mở mang kiến thức ngành công nghệ thực phẩm nói chung mơn phân tích vi sinh nói riêng Và đặc biệt chân thành cảm ơn Thầy Nguyễn Thành Luân tận tình truyền đạt kiến thức hướng dẫn chúng em làm tiểu luận Do kiến thức hạn chế nhiều yếu tố khách quan, chủ quan khác vấn đề tìm thông tin tài tiểu luận nên chúng em khơng thể trách khỏi thiếu xót sai lầm Nhưng chúng em cố gắng hết khả để hồn thành đề tài giao cách tốt Vì mong thầy góp thêm ý kiến để tiểu luận sau chúng em hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn! LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, xã hội phát triển vấn đề sức khoẻ trọng hết, quan tâm bệnh tả có gây ảnh hưởng đến tính mạng người Bệnh tả (Cholera) loài đặc hữu Châu Á, Trung Đông, Châu Phi, Nam Trung Mỹ, Bờ Vịnh Hoa Kỳ Các ca bệnh di chuyển vào châu Âu, Nhật Bản, Úc gây bùng nổ cục Ở vùng lưu hành, bùng phát thường xảy tháng ấm áp Tỷ lệ mắc bệnh cao trẻ em Ở khu vực bị ảnh hưởng, dịch bệnh xảy mùa lứa tuổi dễ bị tổn thương Vibrio cholerae loại vi khuẩn Gram âm (-) tác nhân gây bệnh tả, bệnh tiêu chảy nặng, xảy thành dịch bệnh lẻ tẻ, thành dịch bệnh lưu hành tiếng gây tiêu chảy nghiệm trọng gây nước dẫn đến tử vong vịng 48 không điều trị kịp thời Vibrio cholerae mầm bệnh ngoại bào ruột non, báo cáo toàn cầu chủ yếu nước phát triển, nơi mà lây truyền ngày càg trầm trọng điều kiện vệ sinh đói nguyên nhân dẫm đến hàng triệu ca tử vong năm Để đáp ứng thắc mắc bệnh khuẩn tả ảnh hưởng đến tính mạng người, điều mà người ln quan tâm hết sức khoẻ,nhóm đưa nhiều phương pháp để nhận biết cách khắc phục bệnh tả “Vibrio cholerae” gây nên I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Vibrio – phẩy khuẩn, vi sinh vật hình que trơng dấu phẩy, gram (-), có khả di động lồi kỵ khí tùy tiện Tuy nhiên, gây bệnh cho người có lồi là: V culnificus, V cholerae, V alginolyticus V parahaemolyticus Để làm rõ khả gây bệnh lồi nhóm chọn V cholerae để phân tích V cholerae lồi vi sinh vật đặc biệt lồi cịn lại sinh sống vùng nước lồi cần muối cho sinh trưởng thân nên xuất vùng ven biển Do vậy, khả gây bệnh V cholerae cao loài phân bố rộng V cholera có phản ứng oxidase (+) arginine dehydrolase (-), sinh trưởng phát triển canh trypton 420C, có khả lên men sucrose, khử NO3 thành NO2 Tuy nhiên, chúng khơng thể phát triển mơi trường có nồng độ muối cao nồng độ muối – 3% chúng phát triển bình thường Hình Vibrio cholerae 1.2 Tầm quan trọng việc nghiên cứu Vibro cholerae Virio cholerae nguồn nguyên nhân gây bệnh tả, nghiêm trọng thành đại dịch để lại nhiều hậu cho người Bệnh tả loại tiêu chảy cấp tính qua nhiều kỷ ảnh hưởng đến hàng triệu người giới Các đợt bùng dịch tả thường kèm theo thiên tai, chiến tranh, biến đổi khí hậu gia tăng tồn cầu hóa Đây vấn đề tồn cầu mang tính dai dẳng so với thập kỷ trước (Colwell 1996) Trong lịch sử, bệnh tả nằm mức nghiêm trọng có bệnh so sánh với Là bệnh người có thành phần số lượng mơi trường đáng kể Bệnh bắt đầu người ăn phải thức ăn nguồn nước có chứa vi khuẩn gây bệnh Nó bắt đầu đến ruột non bám vào tiết độc tố vi khuẩn tả (CT) Sau đó, bị tiêu chảy nghiêm trọng hàm lượng độc tố đủ ngưỡng gây độc lại tiếp tục theo phân người mơi trường tiếp tục vịng tuần hồn gây lây lan diện rộng Vi khuẩn Virio cholerae sống hai mơi trường hệ sinh thái nước ký sinh vật chủ người Do vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn đóng vai trò quan trọng người Giúp vạch chiến lược ngăn chặn dịch tả xuất hiện, đưa biện pháp điều trị cho bệnh nhân tả, giảm tỷ lệ tử vong tới mức thấp nhất, có phương hướng giải dịch tả bùng phát bên cạnh nghiên cứu sâu để khai thác lợi ích vi khuẩn đem lại Bên cạnh giúp người hiểu thêm phần giới vi sinh vật 1.3 Một số kỹ thuật dùng để phân tích Vibrio cholerae: Chỉ có nhóm huyết O gây bệnh tả khoảng 140 nhóm huyết phẩy khuẩn tả Vi khuẩn tả gồm loại: O1 (gây dịch tả); O139 (gây bệnh tả); O1 khơng phải O139 (gây viêm ruột cấp tính) Có biotype (tuýp sinh học) vi khuẩn tả cổ điển (do Robert Koch tìm thấy năm 1883) tả El Tor (do Gotschlich tìm thấy năm 1905 Eltor – Ai Cập) thuộc Vibrio cholerae Mỗi tuyp lại chia tuyp huyết Hikojima, Inaba Ogawa Năm 1816 – 1926 tả cổ điển gây vụ đại dịch tả giới Bắt đầu từ năm 1961 đến tả Eltor gây đại dịch lần thứ Tại miền Nam Ấn Độ vào cuối năm 1992 phát chủng O 139… Qua ta thấy vi khuẩn Vibrio cholerae có nhiều biến thể gây bệnh Tùy vào mục đích, yêu cầu, khả năng, điều kiện mà sử dụng nhiều kỹ thuật khác để phân tích Vibrio cholerae Chẳng hạn, để phát trực tiếp vi khuẩn tả thể người bệnh dùng phương pháp xét nghiệm nuôi cấy phân để phân lập vi khuẩn gửi lên tuyến cao để xác định chủng huyết phục vụ cho việc điều trị Để xác định đoạn gen đặc hiệu Vibrio cholerae dùng kỹ thuật PCR (kỹ thuật di truyền phân tử) Xét nghiệm ELISA dùng cho phát định lượng độc tố vi khuẩn… Hay để định danh loài vi khuẩn ta có phương pháp thử nghiệm sinh hóa thử nghiệm decarboxylaza, thử nghiệm khả sinh indol,… - Phương pháp nuôi cấy để phân lập vi khuẩn phương pháp tiêu chuẩn chuẩn đoán vi khuẩn thuộc đường ruột Người ta dùng phương pháp xác định tuyp huyết để làm kháng sinh đồ phục vụ điều trị Do tính đặc hiệu, dụng cụ quan sát đơn giản (kính hiển vi) sẵn có dịng phân lập để dùng thử nghiệm bao gồm tính nhạy cảm dễ phát vi khuẩn đường ruột nhờ vào xét nghiệm miễn dịch lưu hành thị trường mà phương pháp coi tiêu chuẩn vàng Tuy nhiên, phương pháp có nhiều hạn chế độ nhạy kém, thời gian phát mầm bệnh lâu, nhân viên phải qua đào tạo chuyên sâu, phải có kinh nghiệm dẫn đến thiếu nguồn lực vài nơi, đòi hỏi phải cung cấp đầy đủ trang thiết bị để phát mầm bệnh không phát tất mầm bệnh dựa vào liều xét nghiệm miễn dịch chúng có độ nhạy thấp Đối với phương pháp mẫu đưa trực tiếp vào thạch TCBS, TTGA, CHROMagar Vibrio làm giàu peptone môi trường kiềm đánh dấu để phân lập loại thạch Để cải thiện khả phát phân lập mẫu mẫu từ mơi trường nên làm giàu mẫu trước Bắt đầu phân lập V cholerae sau thời gian ủ bệnh xác nhận PCR phân tích sinh hóa.Tiếp đến, dùng xét nghiệm ngưng kết phiên kính mồi PCR kháng huyết cho kháng nguyên O1 O139 để phân nhóm huyết O1, O130, O1/không phải O130 Sau đó, lưu trữ phân lập thạch dinh dưỡng 0,5% NaCl phủ dầu khống vơ trùng glycerol dự trữ - 700C Để đảm bảo khả sống độ tinh khiết mẫu cần phân lập lại theo định kỳ - Phương pháp PCR dùng để chuẩn đốn nhiều loại bệnh người, nhiều loại phân tích thí nghiệm Người ta dùng phương pháp để xác định đoạn gen đặc hiệu vi khuẩn tả dựa vào khuôn DNA sau khuếch đại, nhân số lượng nhờ cặp mồi enzyme polymerase đặc hiệu Là phương pháp quan trọng việc hỗ trợ chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, xét nghiệm di truyền Độ nhạy độ đặc hiệu cao Tuy nhiên, phương pháp yêu cầu phải có thiết bị đắt tiền mà khơng phải phịng thí nghiệm có khả mua máy tuần hồn nhiệt, khay khuếch tán agargel, tách DNA… Để thực phương pháp nhân viên phải đào tạo, phải có trình độ kinh nghiệm Nhưng phạm vi chuẩn đốn hạn chế, tốn khơng phải có khả thực Khơng thế, phương pháp bị giảm độ nhạy độ đặc hiệu xuất kết dương tính giả âm tính giả khơng phân biệt tế bào sống chết Mồi chuyên biệt phương pháp đoạn DNA ngắn bắt cặp với đầu mạch khn Để nhìn thấy sau nhuộm, thu nhận thao tác gen cần khuếch đại trình tự gen Q trình khuếch đại: Thơng tin mồi bổ sung chuyên biệt bắt cặp bổ sung với đầu DNA DNA mồi khuếch đại Có bước chu kỳ, nhiều chu kỳ lặp lại tạo thành phản ứng PCR lần số lượng mẫu tăng theo cấp số nhân bước là: o Bước (biến tính): DNA biến tính 30 – 60 giây 94 – 950C, mạch đơn tạo thành từ việc tách mạch đôi o Bước (bước lai): mạch khuôn bắt cặp với mồi 30 – 60 giây 40 – 700C o Bước (bước tổng hợp): nâng nhiệt độ lên 720C để DNA polymerase thực việc tổng hợp khoảng 30 giây đến vài phút o Sau đó, DNA nhuộm ethidium bromide quan sát tia UV () thông qua điện di sản phẩm gel agarose Ở Việt Nam, quy trình được đưa sau: o Bước 1: tăng sinh khoảng 10 – 20 (tùy đối tượng) khơng chọn o Bước 2: thu dịch nuôi cấy, ly tâm loại tạp chất gộp sinh khối, huyền phù lọc tế bào 10 phút 1000C với V = dung dịch TE (10 mM Tris HCl; pH = 8,0; mM EDTA) - Phương pháp ELISA – phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme, dùng để phát định lượng độc tố vi khuẩn tả sau vài vi sinh vật bắt đầu tăng sinh Đây phương pháp sử dụng nhiều dễ thực hiện, đơn giản (hiện nhờ vào kit) mở rộng quy mơ xét nghiệm phục vụ có lượng lớn bệnh phẩm hay bùng dịch tả Đồng thời, độ nhạy với hầu hết kháng nguyên phương pháp cao Nguyên tắc: Kháng thể thu kháng nguyên + kháng nguyên kháng nguyên bề mặt giếng + enzyme có chất đặc hiệu Với phương pháp thử nghiệm sinh hóa người ta dùng để dịnh danh lồi vi sinh vật Dựa vào đặc tính loại để phát vơ số lồi khác Chẳng hạn: Thử nghiệm decarboxylase: điều kiện kỵ khí, số axit amin, CO2 diamide bị loại bỏ nhóm –COOH enzyme carboxylase Có loại thử nghiệm decarboxylase kiểm nghiệm vi sinh ornithin, arginine lysine decarboxylase Ở đây, nhóm chọn thử nghiệm ornithin decarboxylase (ODC) để phân tích sản phẩm phân tích CO2 putrescine CO2 sinh dùng làm thị pH Thử nghiệm indol: indol chất phản ứng với thuốc thử p – Dimethylaminobenzen tạo phức chất có dạng màu đỏ gọi quinone Qua diễn giải trên, thấy khơng phải phương pháp sử dụng mà phải tùy vào trường hợp, điều kiện sở vật chất, người, mục đích, yêu cầu, mặt ưu hạn chế phương pháp phân tích,… mà lựa chọn phương pháp để thực cho phù hợp II KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Kỹ thuật dùng để tổng hợp DNA dựa khn trình tự DNA giúp khuếch đại đoạn DNA nằm hai đoạn DNA nhờ nhận hàng triệu sử dụng để phát tác nhân gây bệnh, mầm bệnh vi sinh vật đặc biệt Vibrio cholerea có thực phẩm 2.1 Vật liệu phương pháp 2.1.1 Các chủng vi khuẩn Vibro cholerae O139 Vibrio cholerae O1 El Tor sử dụng để đối chứng dương tính Cịn Vibrio cholerae O108 dùng làm đối chứng âm tính để phát triển xét nghiệm PCR.Tất chủng vi khuẩn nuôi cấy môi trường LB; bổ sung 1% NaCl để nuôi cấy canh môi trường thạch 2.1.2 Chuẩn bị AND Tất chuẩn vi khuẩn nuôi cấy môi trường LB 370C Sau tăng trưởng qua đêm, dịch cấy pha lỗng 10 lần đệm Tris-HCl sau đem đun sơi khoảng 10 phút Tiếp đến đem ly tâm, xuất phần phía sử dụng làm mạch khn cho PCR Thực mật độ quang học 0,6 bước sóng 600 nm để xác định độ nhạy vi khuẩn ni cấy Đồng thời, để định lượng Vibrio cholerae O139 O1 mẫu pha loãng thực cách xác định số lượng khuẩn lạc sống thạch LB 2.1.3 Mồi PCR Tất DNA polymerase cần mồi chuyên biệt, mồi đoạn DNA ngắn có khả bắt cập bổ sung với đầu mạch khn nối dài để hình thành mạch Để thiết kế mồi bổ sung hai đầu mạch cần phải có thơng tin tối thiểu trình tự DNA Khi cung cấp hai mồi bổ sung hai đầu có hàng triệu đoạn DNA nằm hai mồi Các đoạn mồi O1 O139 rfb tổng hợp tổng hợp DNA Oligo 1000M (Beckman, Hoa Kỳ) tinh HPLC pha đảo ngược 2.1.4 Giao thức PCR Khuếch đại với ba cặp mồi thực đồng thời ống ly tâm siêu nhỏ 0,2 ml Điều kiện khuếch đại sử dụng phút 940C để biến tính DNA ban đầu 35 chu kỳ, chu kỳ bao gồm phút 940C, phút 550C, phút 720C, với vòng kéo dài cuối Trong phút 720C Bộ tuần hoàn nhiệt độ Gradient DNA Robo Cycler (Stratagene, La Jolla, CA, USA) Sau khuếch đại, DNA nhuộm ethidium bromide dễ dàng phát nhờ điện di gel 2.2 Kết Độ nhạy độ đặc hiệu xét nghiệm PCR đa mồi Các mồi đặc hiệu Vibrio cholerae O1 O139 thiết kế từ vùng cụ thể cụm rfb hai nhóm huyết Xác định độ nhạy xét nghiệm PCR đa mồi kiểm tra cách thay đổi tỷ lệ nghịch lượng DNA khuôn mẫu O1 O139 Để phát tối thiểu kỹ thuật PCR đa mồi thiết lập cách kiểm tra mẫu cấy vi khuẩn Vibrio cholerae O1 O139 pha loãng nước Giới hạn phát Vibrio cholerae O1 O139 65 cfu 200 cfu cho lần xét nghiệm III KỸ THUẬT ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY) Có số xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với hạt ELISA nhằm phát định lượng độc tố tả (hay gọi choleragen viết tắt CTX) Vibrio cholerae tạo môi trường nuôi cấy vi khuẩn Khi mơi trường đệm pH tối ưu hạt ELISA phát liên tục 40pg/ml CTX Để đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu hạt ELISA thực cách sử dụng 239 chủng Vibrio cholerae Các chủng cấy vào 2ml nước dùng Cassmino, acid – Yeast Extract nuôi cấy 370C 18 Sau chủng qua lọc màng bảo quản -800C sử dụng Ảnh hưởng môi trường khác lên hạt ELISA: Tất môi trường sử dụng để nuôi cấy Vibrio cholerae kiểm tra để xác định thành phần mơi trường có ảnh hưởng đến khả phát CTX hạt ELISA IV CÁC PHƯƠNG PHÁP 4.1 Phương pháp định tính: 4.1.1 Phạm vi áp dụng: Được tham chiếu theo TCVN 7905-1:2008 (ISO/ TS 21872-1:2007) Tiêu chuẩn quy định phương pháp phát hai loài Vibrio gây bệnh đường ruột người Vibrio cholerae Vibrio parahaemolytius Tiêu chuẩn áp dụng cho: - Các sản phẩm thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Các mẫu môi trường khu vực chế biến vận chuyển thực phẩm 4.1.2 Nguyên tắc: Để phát Vibrio cholerae thực phẩm thực cách cân lượng mẫu xác định nuôi ủ môi trường lỏng chọn lọc Từ dịch khuẩn cấy chuẩn sang môi trường rắn chọc lọc Các khuẩn lạc giống Vibrio cholerae tiến hành thử nghiệm phản ứng sinh hóa 4.1.3 Mơi trường hóa chất Bảng Mơi trường hóa chất phương pháp định tính Mơi trường hố chất Mục đích APW ( Alkaline Phosphat Water) Tăng sinh chọn lọc TCBS (Thiosulohate Citrate Bile salt Sucrose) Phân lập Ornithine decarboxylase Thử nghiệm sinh hóa để khẳng định TW ( Trypyone Water) Kowacs Thuốc thử Indol 10 4.1.4 Các bước tiến hành 11 Đồng 25g mẫu với 225ml APW ủ 6h ± 1h Ở 41,50C ± 10C sản phẩm tươi Ở 370C ± 10C sản phẩm đông lạnh sâu khô Phân lập môi trường TCBS, ủ 24h ± 3h 370C Ít khuẩn lạc điển hình mơi trường Nếu khuẩn lạc lấy tất khuẩn lạc Thạch dinh dưỡng muối ủ 370C 24h ± 3h Khẳng định sinh hóa Thử nghiệm decarboxylase Thử nghiệm Indol 4.1.5 Quy trình phân tích: 12 Đồng 25g mẫu với 225ml APW Tăng sinh lần Phân lập TCBS Tăng sinh lần Ủ 37,0 ± 0.50C 24h Ornithin (decarboxylaza) Indol Cấy dung dịch muối lỏng bề mặt Cấy 5ml môi trường muối tryton-tryptophan Thêm 1ml dầu khống vơ trùng Ủ 370C 24h Ủ 370C 24h Thêm 1ml thuốc thử Kovac's Vibrio cholera : hình thành vịng màu đỏ Vibrio cholera: màu tím 13 Thử nghiệm khẳng định Vibrio cholerae: a Phát ornithin tách nhóm Cacboxyl (Decarboxylaza ) – ODC: Nguyên tắc: Các loài vi khuẩn đường ruột khác mức độ cảm ứng tạo thành enzyme carboxylase đóng vai trị làm xúc tác phản ứng để loại bỏ nhóm Cacboxyl vài acid amin để tạo amine diamine CO2 điều kiện kỵ khí Phản ứng xúc tác Lysine decacboxyl loại bỏ CO2 khỏi lysine giải phóng CO2 tạo thành cadaverine Khi CO2 sinh làm tăng pH môi trường, đồng thời ghi nhận đổi màu thị pH Phương pháp tiến hành: Cấy dung dịch muối lỏng bề mặt Thêm khoảng 1ml dầu khống vơ trùng lên mặt môi trường Ủ 370C 24 h ± h Oxi tan môi trường vi khuẩn sử dụng để tăng trưởng đồng thời làm mơi trường trở nên cạn kiệt oxi Khi enzyme decacboxylase cảm ứng có diện chất phản ứng chuyển hóa diễn Sau quan sát tạo màu mơi trường Đọc kết quả: Khi mơi trường có màu tím trở nên đục thử nghiệm dương tính (+) có vi khuẩn mọc có tách nhóm decacboxyl ornithin Thử nghiệm âm tính (-) môi trường xuất màu vàng b Phát Indol: Nguyên tắc: Các sản phẩm có chứa gốc indol tạo nên từ Trytophan (là acid amin bị oxi hóa vài vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase) sản phẩm trung gian phản ứng oxi hóa tryptophan indolpyruvic acid IPA bị biến đổi theo hướng loại nhóm deamination thành indol Phương pháp tiến hành: Ở thử nghiệm môi trường sử dụng môi trường muối trypton – tryptophan Thuốc thử Kovacs Cấy khuẩn vào ống chứa 5ml môi trường muối tryton- tryptophan Ủ 370C 24h Sau ủ, bổ sung 1ml ether lắc chiết tách indol lên lớp dung môi hữu Sau thêm 1ml thuốc thử Kovacs Để yên vài phút, theo dõi tạo màu lớp dung môi hữu 14 Đọc kết quả: Trên bề mặt mơi trường hình thành vịng màu đỏ thử nghiệm dương tính (+) Vịng màu nâu – vàng thử nghiệm âm tính (-) 4.2 Phương pháp ni cấy phân lập 4.2.1 Phạm vi áp dụng: - Chuẩn đoán vi khuẩn thuộc đường ruột - Xác định tuyp huyết để làm kháng sinh đồ phục vụ điều trị 4.2.2 Phương pháp tiến hành: Dùng que cấy vòng vừa chạm vào mẫu thành đường zich zắc bề mặt môi trường tăng sinh chọn lọc lên bề mặt đĩa thạch Thiosulohate Citrate Bile salt Sucrose (TCBS) để phân lập khuẩn lạp đơn Sau đường ria liên tục đốt khử trùng que cấy làm nguội que thực thao tác Sau thực xong lật ngược đĩa ủ 370C vòng 18 đến 22 Sau ủ, kiểm tra đĩa có mặt Vibrio cholerae đánh dấu vị trí đáy đĩa Sau đó, cấy chuyền sinh khối từ Vibrio cholerae môi trường phân lập sang môi trường không chọn lọc ủ qua đêm nhiệt độ 370C để thu sinh khối cho thử nghiệm sinh hoá 4.2.3 Đọc kết quả: Hình Khuẩn lạc Vibrio cholerae môi trường Thiosulohate Citrate Bile salt Sucrose Trên bề mặt mơi trường hình dạng Vibrio cholerae có đường kính khoảng đến mm, có màu vàng, phẳng xung quanh Vibrio cholerae có quầng trắng đục 15 V PHÂN TÍCH CÁC PHƯƠNG PHÁP 5.1 Phương pháp Elisa Được ứng dụng rộng rãi nông nghiệp, y học, đặt biệt quy trình kiểm tra kiểm tra chất lượng sản phẩm sinh học - Trong y học: Xét nghiệm HIV để xác định kháng nguyên p24 Chuẩn đoán, điều trị bệnh viêm gan siêu vi B C, bệnh ung thư - Trong thực phẩm: Dùng để phát độc tố có tảo Phát vi khuẩn E.coli, Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, sán gan… thực phẩm Phát chất chloramphennicol tôm, cá sản phẩm thủy sản Kiểm tra dư lực kháng sinh thực phẩm, tàn dư thuốc diệt cỏ… Ngoài ra, ưu điểm khác biệt Elisa hạt so với RPLA khả xét nghiệm cũ để định lượng cholera toxin xác cách ngoại suy lượng cholera toxin tạo từ đường cong chuẩn.Vì vậy, Elisa lựa chọn trở thành phương pháp phát cholera toxin phịng thí nghiệm lâm sàng 5.2 Phương pháp PCR: Phương pháp PCR dùng để chuẩn đốn nhiều loại bệnh người, nhiều loại phân tích thí nghiệm Là phương pháp quan trọng việc hỗ trợ chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, xét nghiệm di truyền Độ nhạy độ đặc hiệu cao Được ứng dụng nhiều y học Bảng Một số ứng dụng PCR phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm Việt Nam (PTN Công nghệ sinh học phân tử, trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM) Vi sinh vật Mẫu thực phẩm Thời gian phát (giờ) 16 ĐỘ nhạu phản ứng PCR (CFU/phản ứng) Độ nhậu phương pháp thực (CFU/25kg mẫu) E coli Thị heo, sữa, rau cá 12 90 10 E coli (ETEC) Thịt heo, sữa tươi, rau 14 700 E coli 0157:H7 Thịt thủy sản 16 90 10 Salmonella spp Thịt thủy sản 12 200 Staphylococcus aureus Thịt hộp, sữa tươi, rau cá, thịt thủy sản 24 200 10 V chalerae Thịt thủy sản 14 30 10 V parahacmolyticus Thịt thủy sản 16 370 10 - Phát vi khuẩn kháng thuốc - Chuẩn đốn tác nhân khơng ni cấy (virut viêm gan B.C, virut HIV, herpes, vi khuẩn chlamydia, mycoplasma…) Trong công nghệ sinh học: xét nghiệm sinh học phân tử ứng dụng lập đồ gen, giải mã trình tự ADN, phát gen, dịng hóa gen,… Trong ngành thực phẩm: phát số vi sinh vật gây bệnh có thực phẩm 5.3 Phương pháp nuôi cấy phân lập: Là phương pháp quan trọng để phân tích nhiều loại bệnh người, nhiều loại phân tích thí nghiệm Thành tựu bật như: “bắt” thành công virus SARS – CoV, virus cúm A/H5N1, thành công phân lập virus SARS – CoV – VI SO SÁNH QUI TRÌNH THEO TCVN VÀ ISO Bảng Tiêu chuẩn TCVN ISO phương pháp PHƯƠNG PHÁP TCVN ISO 17 Theo TCVN 11134:2015 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố PCR TCVN 7607:2017 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương Kỹ thuật ELISA pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Nuôi phân lập TCVN 9716:2013 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC 147 Chất lượng nước biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố ISO 22174:2005 hoàn toàn tương đương với TCVN 11134:2015 ISO 21572:2013 TCVN hoàn toàn tương đương 7607:2017 ISO 8199:2005 hoàn toàn tương đương với TCVN 9716:2013 Bảng So sánh ưu nhược điểm phương pháp PCR Elisa Phương pháp PCR Ưu điểm Phương pháp Elisa Cho kết xét nghiệm nhanh, thường không kể từ bắt đầu làm xét nghiệm Xét nghiệm PCR cho kết định lượng xác số copies virus/ ml máu Từ hỗ trợ đắc lực cho bác sĩ đánh giá hiệu điều trị, tiên lượng giai đoạn bệnh 18 Ưu điểm phương pháp độ nhạy cao cần tạo loại kháng kháng thể mang enzyme để nhận biết cho nhiều kháng nguyên khác Nhược điểm Xét nghiệm PCR khó thực cách chuẩn mực phịng thí nghiệm lâm sàng Giá thành cao Địi hỏi trình độ kỹ thuật viên, bác sĩ phải người có trình độ cao Địi hỏi trang thiết bị , máy móc kỹ thuật đại Tuy nhiên nhược điểm tăng số bước thực làm tăng việc kiểm sốt điều kiện, q trình thực xét nghiệm kéo dài thời gian chẩn đoán TÀI LIỆU THAM KHẢO Asoke C Ghose et al., 2011 Feb Lessons from cholera & Vibrio cholerae Indian Journal of Medical Research Kathryn L Cottingham et al., 01 March 2003 Environmental microbe and human pathogen: the ecology and microbiology of Vibrio cholerae ESA Journals Deborah A Chiavelli et al., 01 July 2001 The Mannose-Sensitive Hemagglutinin of Vibrio cholerae Promotes Adherence to Zooplankton ASM Journals Cục Y tế dự phòng, Bộ Y tế, 17/6/2016 Bệnh tả Truy cập vào 9/8/2021, https://vncdc.gov.vn/benh-ta-nd14498.html Jordi Vila et al., 2016 New molecular diagnostic tools in traveller’s diarrhea Journal of Travel Medicine Muhammad Amjad, 2019 An Overview of the Molecular Methods in the Diagnosis of Gastrointestinal Infectious Diseases International Journal of Microbiology MT Rahman et al., 2013 Polymerase Chain Reaction (PCR): A Short Review Modern Medical College Journal Giáo trình Phân tích vi sinh thực phẩm (trường đại học Công nghiệp thực phẩm) TCVN 9977:2013 10 “Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm” Trần Linh Thước, Nhà xuất giáo dục 11 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4884:2005 (ISO 4833 : 2003) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng vi sinh vật đĩa thạch 19 ... thành phương pháp phát cholera toxin phịng thí nghiệm lâm sàng 5.2 Phương pháp PCR: Phương pháp PCR dùng để chuẩn đoán nhiều loại bệnh người, nhiều loại phân tích thí nghiệm Là phương pháp quan... kết quả: 16 V Phân tích phương pháp .16 5.1 Phương pháp Elisa 16 5.2 Phương pháp PCR: 17 5.3 Phương pháp nuôi cấy phân lập: 18 VI So sánh qui... trên, thấy khơng phải phương pháp sử dụng mà phải tùy vào trường hợp, điều kiện sở vật chất, người, mục đích, yêu cầu, mặt ưu hạn chế phương pháp phân tích, … mà lựa chọn phương pháp để thực cho phù