Tìm hiểu và phương pháp phân tích VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 9 NĂM 2021 2 BỘ.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM -  - BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG NĂM 2021 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM -  - BÁO CÁO TIỂU LUẬN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG NĂM 202 MỤC LỤC DANH MỤC ẢNH DANH MỤC BẢNG BIỂU MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Bệnh truyền qua thực phẩm mối lo tiềm ẩn nhiều loại thực phẩm khác bao gồm hải sản Một phân tích bệnh thực phẩm liên quan đến hải sản báo cáo cho Hệ thống giám sát bùng phát dịch bệnh thực phẩm Hoa Kỳ từ năm 1973 đến năm 2006 Trong khoảng thời gian 33 năm này, có 188 vụ bùng phát, 4.020 ca bệnh, 161 ca nhập viện 11 ca tử vong báo cáo tác nhân vi khuẩn, vi rút ký sinh trùng, hải sản xác định phương tiện thực phẩm Khoảng 3/4 số vụ bùng phát 2/3 số ca bệnh báo cáo tác nhân vi khuẩn, 1/5 số vụ bùng phát khoảng 1/3 tổng số ca bệnh vi rút 5% số vụ bùng phát bệnh ký sinh trùng Vibrio parahaemolyticus xác định tác nhân gây bệnh vi khuẩn thực phẩm quan trọng năm gần V parahaemolyticus tác nhân hàng đầu gây bệnh viêm dày ruột cấp tính người, chủ yếu sau tiêu thụ sản phẩm biển sống, nấu chưa chín chế biến sai cách Chủng lần xác định nguyên nhân gây bệnh thực phẩm Osaka, Nhật Bản vào năm 1950, nơi bùng phát 272 trường hợp viêm dày ruột cấp tính sau ăn cá mồi trắng (shirasu), dẫn đến 20 ca tử vong Năm 1958, chủng vi khuẩn phân lập từ bệnh nhân liên quan đến vụ ngộ độc thực phẩm Thượng Hải, Trung Quốc Hội chứng phổ biến liên quan đến nhiễm V parahaemolyticus viêm dày ruột, bệnh tự giới hạn mức độ nghiêm trọng trung bình Hầu hết trường hợp nhiễm trùng điều trị kháng sinh uống Tuy nhiên, nhiễm trùng gây tử vong bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch người có tình trạng bệnh từ trước, chẳng hạn bệnh gan tiểu đường Mục tiêu đề tài Hiểu rõ vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus khả gây bệnh thực phẩm Biết phương pháp, nghiên cứu phát Vibrio parahaemolyticus Bố cục tiểu luận gồm phần Phần 1: Mở đầu: trang đến trang 10 Phần 2: Tổng quan: trang 11 đến trang 15 Phần 3: Phương pháp phát Vibrio parahaemolyticus: trang 16 đến trang 28 Phần 4: Kết bàn luận: trang 29 đến trang 36 Phần 5: Kết luận kiến nghị: trang 37 đến trang 40 Phần 6: Tài liệu tham khảo: trang 41 đến trang 42 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Vibrio parahaemolyticus Vibrio parahaemolyticus, hay gọi khác “Tả biển”, loại vi khuẩn Gram âm hình cong, hình que, tìm thấy biển cửa sơng, ăn vào gây bệnh đường tiêu hóa người V parahaemolyticus dương tính với oxidase, hiếu khí cách dễ dàng khơng hình thành bào tử Giống lồi khác chi Vibrio, lồi có tính di động, với trùng roi phân cực, đơn lẻ Hình 1: Vibrio parahaemolyticus kính hiển vi Sự diện vi khuẩn gây bệnh mơi trường biển tồn giới làm dấy lên lo ngại người an tồn thực phẩm vi khuẩn có khả gây bùng phát dịch bệnh tùy thuộc vào điều kiện môi trường V parahaemolyticus loại vi khuẩn Gram âm ưa bóng, thuộc loại vi khuẩn chịu mặn, thường gặp phổ biến rộng rãi môi trường xung quanh cửa sơng, biển ven biển Nó sống động vật hải sản cá, cua, tôm, nhuyễn thể… Chúng phát triển bình thường nhiệt độ 10 – 45°C, nồng độ muối từ 0,5 – 10% pH 4,5 – 9,6 V parahaemolyticus nhạy cảm với nhiệt dễ dàng bị hủy diệt phơi khô thực phẩm Khi xâm nhập vào thể người, sau – giờ, V parahaemolticus gây đau bụng, đau ruột Một số triệu chứng nhiễm Vibrio parahaemolyticus: tiêu chảy, đau bụng, buồn nôn, nôn mửa, sốt ớn lạnh Kháng nguyên V parahaemolyticus có loại: kháng nguyên O, kháng nguyên K kháng nguyên H − Kháng nguyên O kháng nguyên màng tế bào bền với nhiệt, chia thành − − 12 nhóm Kháng nguyên K kháng nguyên vỏ chịu nhiệt kém, chia thành 71 kiểu Kháng nguyên H kháng nguyên tiêm mao, không quan trọng hai loại kháng nguyên Bảng 1: Các kiểu kháng nguyên Vibrio parahaemolyticus Nhóm O Kiểu kháng nguyên K Nhóm O Kiểu kháng nguyên K 1, 25, 26, 23, 28, 41, 56, 58a, 7, 19 64, 69 3, 28 8, 20, 21, 22, 39, 62, 70 a a , 5, 6, 7, 29, 30 , 31, 33, 37, 9, 23, 44 a 43, 45, 48, 54, 57, 58 , 59, 65 4a, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 34, 10 19, 24, 52, 66, 71 42, 49, 53, 55, 63, 67 15, 17, 30a, 47, 60, 61, 68 11 36, 40, 50, 21, 56 6, 18, 46 12 52 a : có kiểu kháng nguyên K nhóm O khác Sự xuất chủng O3: K6 vào năm 1995 sau lan rộng nhiều nước gây số bệnh tiêu chảy bùng phát, đánh dấu đại dịch nhiễm trùng V parahaemolyticus V parahaemolyticus mầm bệnh lây truyền qua thực phẩm, gây vấn đề sức khỏe toàn giới Việc ngăn ngừa nhiễm V parahaemolyticus thực phẩm mối quan tâm sức khỏe cộng đồng quan trọng Chính thế, để thiết lập biện pháp kiểm soát hiệu nhằm giảm nguy nhiễm V parahaemolyticus đảm bảo an toàn thực phẩm, phải có phương pháp phân tích hiệu để phát V parahaemolyticus thực phẩm môi trường 1.2 Phương pháp thường quy 1.2.1 Phương pháp PCR PCR kỹ thuật chuẩn đoán phát minh nhà khoa học Mỹ vào năm 1985 sử dụng phổ biến rộng rãi ngành y học vi sinh vật Kỹ thuật cho tốc độ, độ nhạy độ đặc hiệu vượt trội Nhằm tạo lượng lớn DNA từ mẫu ADN chọn lọc Ứng dụng kỹ thuật PCR dùng để phát vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus thể ở: − TCVN 8710-19:2019 (Quy trình chẩn đốn bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm) 1.2.2 Phương pháp real – time PCR Real – time PCR phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR) Sự tích lũy sản phẩm PCR ghi nhận nhờ fluorescence sản phẩm Giúp xác định diện (định tính) nồng độ ban đầu (định lượng) trình tự DNA/mRNA quan tâm Ứng dụng kỹ thuật real – time PCR dùng để phát vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus thể ở: − ISO 21872:2017 (Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus) − TCVN 11133:2015 (Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase real-time (PCR real-time) để phát định lượng vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa yêu cầu chung) 1.2.3 Phương pháp định lượng MPN Phương pháp định lượng phương pháp dùng để xác định hình dạng, định danh số lượng vi sinh vật có mẫu Một số phương pháp định lượng thường gặp 10 Real – time PCR phát gen tdh 61 mẫu, phương pháp streak plate/đoạn dò phát tdh 15 mẫu Làm giàu APW real – time PCR cần 24 để phát V parahaemolyticus gây bệnh hàu, phương pháp streak plate/đoạn dò cần ngày tốn nhiều tài nguyên Nghiên cứu chứng minh real – time PCR kỹ thuật nhanh chóng đáng tin cậy để phát V parahaemolyticus sở hữu gen tdh gây bệnh môi trường nuôi cấy túy trình làm giàu hàu Đây báo cáo chứng minh hiệu real – time PCR vào việc phát V parahaemolyticus gây bệnh (tdh dương tính) q trình làm giàu hàu Điều cho thấy real – time PCR chứng minh hữu ích việc phát vi khuẩn gây bệnh sản phẩm thực phẩm 3.3 Kết thí nghiệm phương pháp định lượng MPN Dấu hiệu bệnh lí tơm Khi tách bỏ lớp vỏ đầu ngực, quan sát thấy gan tụy teo, dai, nhạt màu, ruột rỗng (Hình 7) Hình 7: Tơm có dấu hiệu gan tụy teo, dai (A) ruột rỗng (B) Khi quan sát mẫu phết kính gan tụy nhuộm Gram mẫu tôm bệnh, phát nhiều vi khuẩn gram âm, hình que vùng mơ phết kính (Hình 8) 28 Hình 8: Kính phết gan tụy tơm khỏe (A) tôm bệnh với cụm vi khuẩn gram âm hình que ngắn (B) (100X) Quan sát tiêu kính phết gan tụy tơm bệnh cho thấy có biến đổi cấu trúc mô gan tụy, số lượng khơng bào ít, tế bào gan thối hóa rơi vào lịng ống, xuất hiện tượng melamin hóa vùng gan hoại tử xuất tế bào máu quanh cụm vi khuẩn vùng bị hoại tử (Hình 9) Hình 9: Gan tụy tơm bệnh có biến đổi cấu trúc mơ gan tụy (A) (10X) Các tế bào gan thối hóa rơi vào lịng ống, tế bào máu tập trung quanh cụm vi khuẩn vùng bị hoại tử (B) (40X) Phân lập định danh vi khuẩn Các chủng vi khuẩn phát triển môi trường TCBS có khuẩn lạc màu xanh, trịn, đường kính – 4mm (Hình 10A) Tuy nhiên khuẩn lạc tiến hành cấy truyền sang đĩa môi trường nutrient agar (NA, Merck) (bổ sung 1,5% NaCl) phát triển có màu kem Khi cấy mơi trường thạch máu (Blood agar base, chứa 5% máu cừu) thấy tất khuẩn lạc có khả gây tan tuyết dạng beta (Hình 10B) 29 Hình 10: (A) Khuẩn lạc môi trường TCBS; (B) Tan huyết dạng beta môi trường máu Sau thực nhuộm Gram, ta thấy vi khuẩn bắt màu đỏ từ kết luận chúng vi khuẩn Gram âm Quan sát kính hiển vi (100X) thấy dạng hình que, có khả di động mơi trường lỏng (Hình 11A) Sau cấy vi khuẩn từ TSA vào ống canh thang bromcresol có chứa lọai cacbohydrat: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton, Dmannoza ủ ống canh thang nhiệt độ 37oC Kết nhận ống thí nghiệm sử dụng glucose manitol cho mơi trường màu vàng (Hình 11B) Kết luận tất chủng có phản ứng dương tính với oxidase, catalase, có khả lên men đường điều kiện kị khí hiếu khí, phản ứng decarboxylase dương tính với lysine ornithine, không sinh ureaza sinh idole, acetoin gelatin, sử dụng đường glucose manitol Hình 11: A.Vi khuẩn gram âm, hình que ngắn (100X); B Vi khuẩn lên men glucose hiếu khí kị khí Sau q trình quan sát phân tích đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập từ tơm bệnh trình bày kết Bảng 30 Bảng 9: Đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa vi khuẩn phân lập từ tôm Chỉ tiêu Nhuộm Gram Hỉnh dạng Phát triển TCBS Di động Sinh catalaza Sinh oxidaza Phản ứng lên men yếm khí Phản ứng lên men hiếu khí Sinh beta – galactosidaza Agrinine Lysine Ornithin Sử dụng Citrate Sinh H2S Sinh ureaza Sinh tryptophane Sinh indole Phản ứng Voges - Proskauer Sinh Gelatinaza Sử dụng đường Glucose Manitol Inositol Sorbotol Rhamnose Sucrose Melibiose Amygdalin Arabinose -1 10 que ngắn xanh + + + + + + + + + + + + + - Chủng vi khuẩn 10-2 10-3 que ngắn que ngắn xanh xanh + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - Số lượng vi khuẩn V parahaemolyticus có mẫu − Nồng độ 10-1: có ống (+) − Nồng độ 10-2: có ống (+) − Nồng độ 10-3: có ống (+) Tra bảng MPN, xác định 1g mẫu thử có 75 vi khuẩn 31 3.4 Kết thí nghiệm phương pháp LAMP Các đặc tính chúng đánh giá cách sử dụng 14 chủng Vibrio, chủng Vibrio, 33 phân lập V parahaemolyticus AHPND Ngoại trừ 33 phân lập V parahaemolyticus AHPND, phân lập khác thử nghiệm, bao gồm mười phân lập V parahaemolyticus môi trường, tạo kết âm tính xét nghiệm LAMP (Bảng 10) Khơng có khác biệt độ đặc hiệu xét nghiệm LAMP – A2 LAMP – A3 để phát V parahaemolyticus AHPND nuôi cấy Tuy nhiên, độ nhạy xét nghiệm LAMP-A3 nuôi cấy khiết tốt so với xét nghiệm LAMP – A2 (Bảng 11) Bảng 10: Độ đặc hiệu mồi để phát V parahaemolyticus AHPND thơng qua xét nghiệm LAMP Lồi V parahaemolyticus V furnissii V fluvialis V vulnificus V mimicus V alginolyticus V harveyi V metschnikovii V cholerae V campbellii V cincinatiensis V splendidus V gazogenes V mytili V parahaemolyticus AHPND Grimontia hollisae Photobacterium damselae Pseudomonas sp Escherichia coli Plesiomonas sp Listeria sp Số chủng phân lập thử nghiệm Số lượng nhận diện tích cực 10 1 2 1 1 LAMP-A2 0 0 0 0 0 0 0 LAMP-A3 0 0 0 0 0 0 0 33 33 33 1 1 1 0 0 0 0 0 0 32 Trong thí nghiệm tơm có gai, độ nhạy phát V parahaemolyticus AHPND thấp hai xét nghiệm LAMP-A2 LAMP-A3 phát 8,8×102 CFU cho phản ứng tất thí nghiệm ba lần 8,8 CFU cho phản ứng trong ba thí nghiệm sử dụng xét nghiệm LAMP-A3 (Bảng 11) Điều khơng có đặc biệt đáng ngạc nhiên thí nghiệm tơm có gai nhiều loại hóa chất hạt phức tạp (chẳng hạn mơ tơm) gây trở ngại cho phản ứng khuếch đại Tuy nhiên, độ nhạy xét nghiệm LAMP tốt (tức từ 0,8 đến 21,3 CFU cho phản ứng) quan sát thấy nghiên cứu trước phát vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh người chứa gen tdh, trh1 trh2 mẫu tơm có gai Xét nghiệm LAMP khơng u cầu dụng cụ đắt tiền kỹ thuật phức tạp Bảng 11: Độ nhạy mồi LAMP-A2 LAMP-A3 để phát V parahaemolyticus AHPND Mẫu Phương pháp Pure Culture Số lượng phân lập CFU/ml CFU/ reaction 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 5.3x104 5.3x103 5.3x102 53 0.5 106 10.6 1.1 0.1 0.01 + + +a -b - + + + + - CFU/ml CFU/ reaction 4.4x107 4.4x106 4.4x105 4.4x104 4.4x103 8.8x104 8.8x103 8.8x102 88 8.8 + + + + - - + + + ± 1/3 - LAMPA2 LAMPA3 Thí nghiệm tơm tít LAMPA2 LAM-A3 Độ pha lỗng Xét nghiệm LAMP-A3 tốt xét nghiệm LAMP-A2 việc phát sinh vật mẫu tơm khơng phát dương tính giả Trước đây, người ta chứng minh nuôi tôm, số lượng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh cho người 33 trầm tích cao so với số lượng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh người Sử dụng xét nghiệm LAMP-A3, nhận thấy tất chất lắng đọng từ ao nuôi tôm xét nghiệm dương tính với V parahaemolyticus AHPND Tất sản phẩm khuếch đại LAMP xác nhận giải trình tự DNA Do đó, diện V parahaemolyticus AHPND tất mẫu trầm tích cho thấy sinh vật tồn môi trường trại ni tơm Do đó, việc kiểm tra hậu ấu trùng trước thả vào ao đất không đảm bảo tôm ao không bị nhiễm V parahaemolyticus AHPND Trong trường hợp này, việc khử nhiễm V parahaemolyticus AHPND trầm tích ao ni tơm xác nhận sau việc khử nhiễm xét nghiệm LAMP hành động cần thực để giảm nguy nhiễm bệnh 3.5 Kết thí nghiệm phương pháp DVC – FISH Phương pháp DVC – FISH định lượng dạng V parahaemolyticus tồn hàu trai, sử dụng cho nghiên cứu sống sót kiểm tra chất lượng thực phẩm tự nhiên mẫu bị nhiễm bẩn Để xác định tính phù hợp kỹ thuật tối ưu hóa để phát tế bào sống sót V parahaemolyticus mẫu hải sản, DVC – FISH áp dụng để theo dõi mầm bệnh khả tồn thông qua nghiên cứu sống sót V parahaemolyticus vi khuẩn Gram âm liên quan đến bệnh liên quan đến hải sản, không gây triệu chứng bệnh viêm dày ruột, mà nhiễm trùng vết thương nhiễm trùng huyết Ưu điểm: Do không thành công với số phương pháp nuôi cấy, kết hợp kỹ thuật phân tử DVC – FISH dường chiến lược hiệu để phát định lượng tế bào sống sót, bao gồm nhập chúng trạng thái VBNC Nhược điểm: kỹ thuật DVC – FISH có số hạn chế định Mặc dù FISH có tính đặc hiệu cao khả định lượng trực tiếp hình ảnh, số hạn chế thời gian thử nghiệm tiêu thụ đầu dị-ngăn chặn việc sử dụng thường xun chẩn đoán Sự lựa chọn kháng sinh ức chế gyrase DNA thích hợp, nồng độ mức độ cần thiết thời gian ủ yếu tố phải tính đến Cuối tiếng 34 ồn xung quanh mẫu hạn chế khả quan sát xác định kích thước tế bào 35 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 So sánh phương pháp Bảng 12: So sánh phương pháp phát Vibrio parehaemolyticus Phương pháp Độ nhạy/Độ đặc hiệu Ưu điểm/Nhược điểm PCR Độ nhạy: độ nhạy cao phụ thuộc vào kĩ thuật PCR, mục tiêu phân tách làm giàu Độ đặc hiệu: có độ đặc hiệu cao PCR sử dụng để phát mật độ vi sinh vật, môi trường, chủng gây bệnh chí chủng đặc hiệu Real – time PCR Độ nhạy: nhạy PCR thông thường Nó giảm bước làm giàu phát số lượng mầm bệnh thấp mẫu Độ đặc hiệu: việc sử dụng đầu dò huỳnh quang mang lại cho xét nghiệm mức độ đặc hiệu cao việc phát vi khuẩn mục tiêu từ mẫu Ưu điểm: cho kết nhanh chóng, xác nhạy PCR cho phép phân biệt chủng gây bệnh so với chủng có mơi trường xung quanh tối ưu hóa để phát chủng xác Có thể thực dạng kĩ thuật Multiplex PCR Nhược điểm: độ nhạy phương pháp bị cản trở thiết bị không tối ưu hóa cải tiến Ưu điểm: hiệu quả, hữu ích, nhanh chóng dễ sử dụng việc phát vi khuẩn Vibrio gây bệnh hải sản Có thể kết hợp phương pháp khác để phát nhanh Nhược điểm: khuếch đại tế chết phát thông qua phương pháp ni cấy khuếch đại cho kết dương tính giả Định lượng MPN Độ nhạy: nhạy Ưu điểm: phương pháp này, phương pháp định lượng thông khuẩn lạc V parahaemolyticus thường môi trường thạch phân lập Độ đặc hiệu: dùng để TCBS có hình dạng đặc trưng định lượng nhóm vi sinh dễ nhận biết, thử nghiệm vật ni cấy sinh hóa nhuộm Gram, thử mơi trường lỏng chọn lọc, phát nghiệm sơ bộ, thử nghiệm khẳng mật độ vi sinh vật có định thử nghiệm bản, dễ thực dễ đọc kết mẫu Nhược điểm: nhiên, phương 36 pháp có hạn chế thời gian phân tích dài, có nhiều thao tác phân tích ước lượng số có xác suất lớn mà cho số cụ thể Ưu điểm: LAMP phương pháp đơn giản, có hiệu chi phí, mang lại kết nhanh chóng để phát vi khuẩn bị nhiễm bệnh Có thể thực nhiệt độ mà không cần tái chuyển Nhược điểm: tương tự PCR, bị ảnh hưởng phương pháp tách mục tiêu làm giàu LAMP Độ nhay: LAMP nhạy so với phương pháp truyền thống chí PCR Độ đặc hiệu: LAMP bị nhiễu với độ đặc hiệu 100% Việc sử dụng nhiều mồi LAMP mang lại độ đặc hiệu cao Có thể sử dụng để phát chủng Vibrio parahaemolyticus môi trường, gây bệnh hai DVC – FISH Độ nhạy: độ nhạy phương Ưu điểm: giúp thống kê số lượng pháp áp dụng để phát vi khuẩn mẫu Vibrio parahaemolyticus số lượng thấp Kết nhanh Độ đặc hiệu: thời điểm này, chóng cụ thể khác biệt Nhược điểm: phương pháp thực cấp độ loài phân biệt Vibrio parahaemolyticus gây bệnh với chủng phân lập từ môi trường Phụ thuộc vào phương pháp nuôi cấy ảnh hưởng đến tốc độ phát 4.2 Kết luận Nhìn chung phương pháp có ưu, nhược điểm riêng Việc lựa chọn phương pháp để tiến hành phân tích, kiểm tra vi sinh vật điều quan trọng Tuỳ thuộc vào nhu cầu, mục đích sử dụng nguồn lực kinh tế mà lựa chọn sử dụng phương pháp thử nghiệm khác Vì “thước đo” để đánh giá xác kết thử nghiệm, đem lại kết tốt hướng xác tương lai 37 4.3 Kiến nghị Hướng phương pháp Có thể tiến hành kết hợp phương pháp với để thực thử nghiệm cho kết tốt, xác nhanh MPN (Most Probable Number) phương pháp phương pháp định lượng Phương pháp MPN “Hướng dẫn phân tích vi khuẩn” Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ (U.S Food and Drug Administration, FDA) mơ tả việc phát lồi Vibrio mẫu thực phẩm Mặc dù phương pháp hữu ích việc phát phân lập lồi Vibrio, phương pháp có số nhược điểm lớn Khối lượng công việc, vật liệu thời gian cần thiết để hồn thành tồn quy trình nhận dạng thường từ – 10 ngày (Tunung cộng sự, 2011) Do đó, để khắc phục nhược điểm, phương pháp MPN kết hợp với phương pháp PCR Phương pháp MPN – PCR cho phép hồn thành việc định lượng vi khuẩn từ mơi trường mẫu hải sản vòng ngày (Miwa cộng sự, 2003; Martin cộng sự, 2004) Các nhà nghiên cứu khác báo cáo thành công phương pháp MPN – PCR việc phát gen cụ thể sinh vật thay phân lập sinh vật mục tiêu để liệt kê vi khuẩn mẫu môi trường thực phẩm (Alam cộng sự, 2002), mẫu đất (Vesa cộng sự, 1997) V parahaemolyticus (Hara – Kudo cộng sự, 2003; Miwa cộng sự, 2003, 2006) Ngoài phương pháp nêu trên, ta tìm sử dụng phương pháp khác để phát Vibrio parahaemolyticus Tại Việt Nam, lĩnh vực Thủy sản xây dựng thành công phương pháp xác định Vibrio parahaemolyticus kỹ thuật Dot blot cho phép phát trực tiếp có mặt gen thị hỗn hợp AND vi khuẩn Thao tác phát đơn giản, xác định 38 hàng loạt mẫu thời gian, thích hợp nghiên cứu điều tra kiểm sốt mơi trường, kiểm nghiệm nhiễm khuẩn thực phẩm Đã hồn thành trình tự Thermostable direct hemolysin (TDH) gen Vibrio parahaemolyticus (based to 426) phân lập Việt Nam Đăng ký ngân hàng liệu gene Quốc tế (GenBank) số đăng ký AY 195739 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Thị Hồng Ánh (chủ biên) Cao Xn Thủy (2017) Giáo trình Vệ sinh An tồn thực phẩm TP Hồ Chí Minh: NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [2] Nguyễn Trọng Nghĩa, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trương Quốc Phú Phạm Anh Tuấn (2015) Phân lập xác định khả gây bệnh hoại tử gan tụy vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phân lập từ tơm ni Bạc Liêu Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ, 39, 99 – 107 [3] Trần Linh Thước (2007) Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm (phiên 3) TP Hà Nôi: NXB Giáo Dục [4] Bệnh viêm ruột Vi-bờ-ri-ơ pa-ra-hê-mơ-ly-ti-cút (Vibrio parahaemolyticus) thuộc nhóm C Luật Phòng, chống bệnh truyền nhiễm (2014) Truy xuất từ http://www.pasteurhcm.gov.vn/news/benh-viem-ruot-do-vi-bo-ri-o-pa-ra-he-mo-ly-ti-cut137.html [5] Alam, M J., Tomochika, K I., Miyoshi, S I., and Shinoda, S (2002) Environmental investigation of potentially pathogenic Vibrio parahaemolyticus in the Seto – Inland Sea, Japan FEMS Microbiol Lett 208, 83 – 87 doi: 10.1111/j.1574-6968.2002.tb11064.x [6] Blackstone, G., Nordstrom, J., Vickery, M., Bowen, M., Meyer, R., & DePaola, A (2003) Detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus in oyster enrichments by real time PCR Journal of Microbiological Methods, 53, 149 – 155 [7] Hara – Kudo, Y., Sugiyama, K., Nishibuchi, M., Chowdhury, A., Yatsuyanagi, J., Ohtomo, Y (2003) Prevalence of pandemic thermostable direct hemolysin – producing Vibrio parahaemolyticus O3:K6 in seafood and the coastal environment in Japan Appl Environ Microbiol 69, 3883-3891 doi: 10.1128/AEM.69.7.3883-3891.2003 40 [8] Hernández, J., Hernández, M & Moreno, Y (2021), Combination of Direct Viable Count and Fluorescent In Situ Hybridization (DVC – FISH) as a Potential Method for Identifying Viable Vibrio parahaemolyticus in Oysters and Mussels Foods, 10(7), 1502 doi: 10.3390/foods10071502 [9] Kongrueng, J., Tansila, N., Mitraparp-arthorn, P., Nishibuchi, M., Vora, G & Vuddhakul, V (2015) LAMP assay to detect Vibrio parahaemolyticus causing acute hepatopancreatic necrosis disease in shrimp Aquaculture International, 23, 1179 – 1188 [10] Letchumanan, V., Chan, K G & Lee, L H (2014) Vibrio parahaemolyticus: a review on the pathogenesis, prevalence, and advance molecular identification techniques Frontiers in Microbiology, 5(705), – 13 doi: 10.3389/fmicb.201400705 [11] Martin, B., Jofre, A., Garriga, M., Hugas, M., and Aymerich, T (2004) Quantification of Listeria monocytogenes in fermented sausages by MPN – PCR method Lett Appl Microbiol 39, 290 – 295 doi: 10.1111/j.1472-765X.2004.01580.x [12] Miwa, N., Kashiwagi, M., Kawamori, F., Masuda, T., Sano, Y., Hiroi, M (2006) Levels of Vibrio parahaemolyticus and thermostable direct hemolysin gene-positive organisms in retail seafood determined by the most probable number-polymerase chain reaction (MPN – PCR) method Medline 47, – 45 [13] Miwa, N., Nishio, T., Arita, Y., Kawamori, F., Masuda, T., and Akiyama, M (2003) Evaluation of MPN method combined with PCR procedure for detection and enumeration of Vibrio parahaemolyticus in seafood J Food Hyg Soc Japan 44, 289–293 doi: 10.3358/shokueishi.44.289 [14] Tuning, R., Ghazali, F M., Noranizan, M A., Haresh, K K., Lesley, M B., Nakaguchi, Y (2011) Rapid detection and enumeration of pathogenic Vibrio parahaemolyticus in raw vegetables from retail outlet Int Food Res J 18, 67 – 68 41 42 ... vi, phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp màng lọc, phương pháp đo độ đục, phương pháp MPN… Ở thí nghiệm sử dụng chủ yếu phương pháp MPN, cịn gọi phương pháp pha lỗng tới hạn hay phương pháp. .. monocytogenes Salmonella spp Vibrio alginolyticus Vibrio cholerae Vibrio fluvialis Vibrio hollisae Vibrio metschnikovii Vibrio mimicus Vibrio vulnificus Vibrio parahaemolyticusc Vibrio parahaemolyticusd... 2006) Ngoài phương pháp nêu trên, ta tìm sử dụng phương pháp khác để phát Vibrio parahaemolyticus Tại Việt Nam, lĩnh vực Thủy sản xây dựng thành công phương pháp xác định Vibrio parahaemolyticus