Tìm hiểu về CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ooo000ooo ĐỀ TÀI CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TP Hồ Chí Minh, 2021 1 MỤC LỤC 1 Tổng quan về clostridium perfringens 2 2 T.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ooo000ooo ĐỀ TÀI CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TP Hồ Chí Minh, 2021 MỤC LỤC Tổng quan clostridium perfringens 2 Tầm quan trọng việc nghiên cứu đối tượng Clostridium perfringens Dùng kỹ thuật khác để phân tích đối tượng C perfringens .9 Phương pháp ELISA 10 Phương pháp PCR .11 Phương pháp nuôi cấy 12 Kỹ thuật định lượng môi trường thạch tryptose sulfide cycloserin (tsc) 14 Phương pháp truyền thống- phương pháp đếm khuẩn lạc .20 Phương pháp phân lập xác định type độc tổ (toxinotype) vi khuẩn clostridium perfringens động vật nhai lại kỹ thuật multiplex pcr .24 10 Nghiên cứu clostridium perfringens 30 1.Tổng quan clostridium perfringens -Phân loại khoa học Loài C perfringens thuộc:  Giới: Bacteria  Ngành: Firmicutes  Lớp: Clostridia  Bộ: Clostridiales  Họ: Clostridiaceae  Chi: Clostridium  Loài: C perfringens Clostridium perfringens (trong khứ gọi C Welchi Bacillus Welchi, mục đích để vinh danh người phát vào năm 1891 xác định tác nhân gây bệnh hoại thư khí, William Henry Welch) vi khuẩn Gram dương, dạng hình que, phát triển điều kiện kị khí (có thể phát triển điều kiện khơng có oxi), vi khuẩn sinh nội bào tử gây bệnh thuộc chi Clostridium, vi khuẩn thích hợp với mơi trường có độ axit tính trung tính định, độ pH lý tưởng nằm khoảng từ 5,5-8 Loại vi khuẩn thực trao đổi chất dựa q trình lên men Về bản, có khả lên men đường glucose, đường sữa đường sucrose Ruột người động vật nơi loại vi khuẩn thường tìm thấy Chúng gây thiệt hại khủng khiếp cho loại sinh vật mà xâm nhập có khả gây tử vong, chúng từ từ giết chết mô bị lây nhiễm không để lại hội phục hồi C perfringens có khả tồn nhiệt độ cao Vi khuẩn phát triển trình làm lạnh giữ thực phẩm nhiệt độ từ 54°F-140°F (12°C-60°C) Và đặc biệt phát triển nhanh khoảng nhiệt độ từ 109°F – 117°F (43 ° C – 47 ° C) Loại vi khuẩn có đặc tính di động: Mặc dù khơng có C.perfringens có khả lướt bề mặt nhờ tồn thể lót sợi tơ (sợi filament) Các biến thể siêu di động (hypermotile) biến thể SM101 thường phát cạnh khuẩn lạc đĩa thạch Video kính hiển vi ghi lại chuyển động trượt chúng cho thấy chúng có cấu trúc hình sợi dài, mỏng cho phép chúng có khả di chuyển nhanh khơng thua vi khuẩn có Clostridium perfringens có khả gây số loại độc tố như: -Enterotoxin: độc tố gây trường hợp ngộ độc thực phẩm -Alpha toxin: thường liên quan đến bệnh hoại thư khí người, ngồi cịn có bệnh viêm ruột hoại tử số động vật gà, gia súc ngựa -Toxin Beta: theo nhiều nghiên cứu cho thấy loại độc tố có khả hoạt động chất độc thần kinh đồng thời tạo co thắt động mạch Ngoài biết đến liên quan tới số bệnh lý đường tiêu hóa số động vật có vú -Toxin Epsilon: Đây chất độc gây chết người sản xuất vi khuẩn chi Có khả gây chứng phù nề da Theo nhiều nghiên cứu khác cho thấy vượt qua hàng rào máu não, thơng qua truy cập thẳng vào não tích lũy -Độc tố Iota: loại độc tố gây nên chứng viêm da đồng thời gây tổn thương cấp độ đường tiêu hóa Tương tự enterotoxic có khả gây độc tế bào C perfringens biết đến nguyên nhân phổ biến gây ngộ độc thực phẩm Anh Quốc Chứng ngộ độc thường xảy với trường hợp thức ăn bị nhiễm vi khuẩn chế biến không cách, điều làm cho C perfringens nhân lên cách nhanh chóng Việc sản xuất độc tố ruột cho nguồn bệnh vi khuẩn gây Ngoài C perfringens biết nguyên nhân gây số bệnh khác nhiễm trùng da mơ sâu Hiện tượng cịn gọi “Bệnh xơ hóa clostridial” “hoại thư sinh khí”, kết độc tố C perfringens gây nên Vết thương sâu bị nhiễm vật lạ có chứa vi khuẩn điều kiện thuận lợi cho bệnh hoại thư quái ác Các loại thực phẩm thường chứa vi khuẩn Clostridium perfringens Thịt bò, thịt gia cầm, nước thịt, thực phẩm khô loại thực phẩm chế biến sẵn nguồn lây nhiễm C perfringens phổ biến Ngoài thức ăn chế biến với số lượng lớn đồng thời giữ ấm thời gian dài trước dùng điều kiện thuận lợi để C perfringens phát triển Các sở bệnh viện, nhà ăn trường học, nhà tù viện dưỡng lão, kiện có phục vụ ăn uống thường khu vực dễ xảy đợt bùng phát dịch Mọi người có nguy bị ngộ độc thực phẩm từ C perfringens Hai nhóm đối tượng có nguy nhiễm C perfringens cao trẻ nhỏ người cao tuổi gặp triệu chứng nghiêm trọng kéo dài từ đến tuần -Các dấu hiệu triệu chứng bị nhiễm vi khuẩn C perfringens: +Ngộ độc thực phẩm: Khi nạn nhân ăn phải thức ăn chứa số lượng lớn vi khuẩn, C perfringens gây tiêu chảy Ngồi có khả xuất số triệu chứng khác buồn nôn, nôn, đau bụng sốt Các triệu chứng thường khởi phát cách đột ngột xảy khoảng từ 8-12 giờ; vài trường hợp đến 24 kể từ ăn 24 thời gian tối đa triệu chứng xuất +Viêm ruột hoại tử: Loại A Bệnh Đối tượng gây bệnh - Hoại thư sinh - Người, động vật, gà - Viêm ruột hoại tử - Heo, gà - Viêm ruột nhiễm độc máu - Bò, cừu non - Ngộ độc thực phẩm - Người - Viêm ruột kết - Ngựa - Viêm dày xuất huyết - Chó B - Bệnh lỵ - Cừu non - Viêm ruột độc máu - Ngựa con, cừu, dê C - Viêm ruột hoại tử - Người - Viêm ruột độc máu - Bê,cừu, heo D - Viêm ruột nhiễm độc máu - Cừu, dê, trâu bò E - Viêm ruột - Thỏ - Viêm ruột nhiễm độc máu - Bê cừu Tiêu chảy triệu chứng xuất nhiễm trùng này, khơng viêm kèm theo vùng thượng vị đau nhói Một số trường hợp xuất triệu chứng sốt, buồn nôn nơn +Bệnh xơ hóa clostridial (hoại thư sinh khí): Các triệu chứng khởi phát cách đột ngột, đặc biệt cảm thấy đau dội vết thương Màu da khu vực bị nhiễm thay đổi (ví dụ: màu thay đổi từ trắng sang đồng, sau tím đỏ) Nạn nhân có cảm giác tồn khí da 2.Tầm quan trọng việc nghiên cứu đối tượng clostridium perfringens Tỷ lệ mắc bệnh viêm ruột hoại tử C perfringens tạo ra, thường thấy thịt cừu, gà loài gia cầm khắp giới C.perfringens gồm có loại (A-E) gây nhiều bệnh khác chí số chủng gây nhiễm trùng cho người động vật Tỷ lệ nhiễm độc tố ruột gia súc nhai lại nhỏ nước khác giới Vì vấn đề quan trọng điều tra dịch tễ học nhận biết xác biến thể C perfringens Hơn nữa, loài nhai lại đặc biệt loại giống địa, đóng vai trị quan trọng phận đáng kể dân cư vùng nhiệt đới từ khía cạnh kinh tế - xã hội Số vụ bùng phát Clostridium perfringens từ 1998 đến 2010 Hoa Kỳ từ 1998 đến 2010 Trung bình, đợt bùng phát C perfringens xác nhận chiếm 5% tổng số đợt bùng phát bệnh thực phẩm xác nhận báo cáo hàng năm Trong tất năm, C perfringens nguyên nhân thứ hai gây đợt bùng phát bệnh vi khuẩn thực phẩm xác nhận sau Salmonella Tỷ lệ bộc phát lên đến 70% Do đó, nỗ lực từ ban quản lý cải thiện di truyền để tăng cường sản xuất có tầm quan trọng thiết yếu Trong vài năm gần đây, việc chăn nuôi đà điểu có bước phát triển vượt bậc ngành chăn nuôi giới đạt số ổn định kinh tế Vai trò Clostridium perfringens khả gây bệnh cừu, gà thịt quan trọng loại độc tố chúng có liên quan đến bệnh dày đường ruột động vật Sau biết khả C perfringens gây bệnh thực phẩm chế biến, nhà nghiên cứu tìm cách kiểm sốt vệ sinh thực phẩm hạn chế ô nhiễm, làm kỹ lưỡng, đóng hộp thích hợp trì thực phẩm nhiệt độ phạm vi phát triển C perfringens Các mặt hàng thực phẩm chế biến sẵn, đặc biệt sản phẩm thịt, phải giữ nhiệt độ nóng lạnh để hạn chế C perfringens tăng lên… Thực phẩm nên ăn vịng sau nấu chín Nếu thực phẩm giữ nhiệt độ ấm để phục vụ sau này, chúng nên giữ nhiệt độ 550C Nếu nhiệt độ giảm xuống 550C, thực phẩm nên hâm nóng 600C Thực phẩm phục vụ lạnh sau nấu phải làm lạnh nhanh đến 20 0C giữ 70C phục vụ Theo Avian Pathology có đề cập, bệnh hoại tử ruột C perfringens nhiễm trùng cận lâm sàng xuất gà sau EU cấm chất kích thích kháng sinh, tăng trưởng làm giảm trọng lượng gây khủng hoảng kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi gia cầm Mối quan tâm tỷ lệ nhiễm C perfringens gia cầm cao nguy lây truyền sang chuỗi thực phẩm gây vấn đề sức khỏe cộng đồng Mặc dù Clostridium perfrngens nguyên nhân gây số lượng lớn vụ ngộ độc thực phẩm châu Âu hàng năm, mặt lý thuyết, việc kiểm sốt ngành cơng nghiệp thịt dễ dàng nhiều so với B cereus ngành công nghiệp sữa Một vấn đề cụ thể với C perfringens chủng hoang dã phân lập từ môi trường ln âm tính với độc tố ruột (Skjelkvile cộng sự, 1979) Một số chủng mang gen khơng dương tính với độc tố ruột Thật vậy, chứng minh chủng âm tính với độc tố ruột chuyển đổi thành dương tính cách tạo q trình bào tử lặp lặp lại sốc nhiệt (750C, 20 phút) (Uemura Skjelkvble, 1976) Ngộ độc thực phẩm C perfringens gây luôn trách nhiệm nhà sản xuất thực phẩm Nếu nhà máy thực phẩm làm khử trùng cách, chuỗi xử lý nhiệt bào tử bị phá vỡ, khơng thể tạo chủng enterotoxin dương tính Tuy nhiên, việc khử trùng thực phẩm bị nhiễm bào tử phải thực cẩn thận Chỉ Hypoclorit điều chỉnh đến pH tiêu diệt bào tử, sau làm thích hợp (Granum Magnussen, 1987) Các giải pháp thay hiệu chi phí phải tìm kiếm cần khẩn trương nghiên cứu thêm vấn đề Trước hết, cần có mơ hình thực nghiệm tái tạo bệnh Mơ hình sau áp dụng cho sản phẩm thử nghiệm, kỳ vọng kiểm soát dịch bệnh Nghiên cứu nên tập trung vào việc tạo biện pháp bảo vệ chống lại bệnh Cân đối thành phần nguyên liệu thức ăn chăn ni có lẽ biện pháp phịng chống kiểm sốt hiệu Tiêm phịng cho gia cầm chống lại C perfringens vấn đề thực nghiêm túc Việc sử dụng prebiotics probiotics chứng minh có hiệu chống lại mầm bệnh khác gia cầm, cần phải có nhiều nỗ lực lĩnh vực Ngoài đại học Mannheim- Đức có nghiên cứu việc điều trị ung thư tuyến tụy cách sử dụng độc tố ruột Clostridium perfringens Độc tố Clostridium perfrigens mục tiêu điều trị cho bệnh ung thư tuyến tụy đề xuất phương thức điều trị cách sử dụng hợp chất CPE (Clostridium perfringens enterotoxin) có sẵn tự nhiên Phân tích phản ứng miễn dịch phát triển chống lại độc tố C perfringens loại A C cho thấy chất bổ trợ từ dầu khoáng tăng cường sản xuất kháng thể chống lại độc tố C perfringens loại A C đo SNT Ở gà tiêm ngừa với Vắc xin kết hợp bất hoạt bổ trợ dầu sativa, hiệu giá kháng thể chống lại độc tố C perfringens loại A C Những kết cho thấy N sativa tăng cường sản xuất kháng thể chống lại chất độc mạnh chất hỗ trợ dầu khoáng Sự khác biệt ảnh hưởng N sativa mức độ kháng thể tạo theo loại tác nhân tạo miễn dịch (hiệu giá kháng thể thấp trường hợp kháng nguyên Salmonella mức độ kháng thể cao trường hợp độc tố C perfringens) khó giải thích C perfringens đóng vai trị phụ việc kiểm tra nước Clostridia sinh vật xây dựng bào tử có khả chống lại nhiệt, khử trùng clo yếu tố khác Trái ngược với tế bào sinh dưỡng coliform (E coli, enterococci)- sức đề kháng hơn, C perfringens có ưu điểm sống lâu Do đó, nhiễm bẩn phân phát chủ yếu coliform chất thị, biến sau bước xử lý, C perfringens tồn Sinh vật mối nguy hiểm nước; hơn, nguy hiểm nước tiếp xúc với thực phẩm 3.Dùng kỹ thuật khác để phân tích đối tượng C perfringens Khi xem xét thực tế, rõ ràng việc phát xác định C perfringens bước quan trọng để kiểm soát tiêu diệt mầm bệnh Một số enzym đặc trưng C perfringens hemolysin (ß-tan máu), lecithinase, protease ngoại bào, lipase (phospholipase- C), collagenase, hyaluronidase, enzym đường hóa enzym khử sulphite thành sunfua Các enzym sử dụng làm mục tiêu phát phân biệt Cũng cần lưu ý C perfringens vi khuẩn khơng di động vi khuẩn quan trọng số clostridia khử sulphite Ngoài ra, C perfringens thường phát triển 44 ° C, số clostridia khác bị ức chế nhiệt độ Tính chất sử dụng phương pháp ISOO để cung cấp cho môi trường có độ chọn lọc cao C perfringens tiếng sở hữu lượng độc tố phong phú, với 15 loại độc tố loài gây bệnh phổ biến giới Do đó, sinh vật có khả tạo bệnh lý khác gây nhiều loại bệnh đường ruột độc tố khác người động vật Alpha (α), beta (β), epsilon (µ) iota bao gồm bốn độc tố C perfringens tạo sở cho việc phân loại vi khuẩn thành năm loại khác nhau, từ A đến E Các loại vi khuẩn khác gây nhiều bệnh khác chí chủng gây nhiễm trùng cho nhiều vật chủ Chủng loại A (alpha-toxin) thường gặp gây chứng hoại thư khí (myonecrosis), tiêu chảy bệnh truyền qua thực phẩm người Các chủng loại B (alpha-, beta- epsilon-độc tố) loại D (alpha- epsilon-độc tố) tác nhân gây bệnh nhiễm độc ruột gây tử vong động vật nuôi người Chủng loại C (độc tố alpha beta) gây viêm ruột hoại tử nghiêm trọng người lợn Khả gây bệnh chủng loại E (độc tố alpha iota) không rõ ràng phân lập người Để giảm thiểu loại bỏ nguy này, chiến lược phải phát triển để chẩn đoán ngăn chặn động vật bị nhiễm bệnh xâm nhập vào chuỗi thức ăn Trong chẩn đoán giả định C perfringens đạt phát lâm sàng bệnh lý, việc xác nhận thực thường xuyên phương pháp phân lập đặc điểm vi sinh thông thường bao gồm ni cấy vi khuẩn, phân tích sinh hóa xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym Trong số phịng thí nghiệm, xét nghiệm trung hịa huyết chuột chuột lang sử dụng để xác định chẩn đoán độc tố vi khuẩn Phương pháp tốn thời gian, tốn chi phí Hơn nữa, việc áp dụng với chi phí gây thiệt hại cho động vật thí nghiệm khơng phù hợp phi đạo đức Theo Timoney cộng sự, kháng độc tố µ huyết cừu đo ELISA, chứng minh phương pháp cụ thể, nhanh chóng phù hợp kinh tế thay xét nghiệm trung hòa huyết ELISA sử dụng kháng thể đa dòng để xác định độc tố C perfringens Tuy nhiên, nhược điểm phản ứng tương tác kháng thể tạo có tác dụng chống lại chất độc, điều gây khó khăn cho việc xác định loại độc tố Hơn nữa, ELISA không xác định độc tố β để xác định độc tố từ vi khuẩn hình thành bào tử, phải kích hoạt phương pháp ni cấy đặc biệt Các xét nghiệm sinh hóa khơng có khả phân biệt loại C perfringens khác PCR công nghệ thực tế đại việc chẩn đoán bệnh truyền nhiễm so với kỹ thuật cổ điển, chứng minh nhanh hơn, với kết thu vài đáng tin cậy PCR cho phép xác định vi khuẩn nhanh trực tiếp từ mẫu lâm sàng 4.Phương pháp ELISA - C.perfringen làm đông sữa nhanh đáy ống nghiệm tạo lớp nhũ tương b) Thử tính chất lên men đường hoá lỏng gelatin - Từ canh trùng cấy vào môi trường lactoza gelatin Sau 24 350C , nhận định khả lên men đường Lactoza, khả sinh Đặt ống nghiệm vào 50C/1 - Đọc kết sơ khả hóa lỏng gelatin - Nếu môi trường dạng đặc, ủ thêm 24 giờ/ 350C c) Khả chuyển hoá nitrat thành nitrit: - Từ canh trùng cấy vi khuẩn vào ống nitrat, ủ 35 oC/24 Nhỏ 0,25ml thuốc thử A B - Quan sát mầu mơi trường chuyển sang mầu cam tím (+)/10 phút Tiêu chuẩn để xác định C perfringen Trực khuẩn ngắn: Gr Có nha bào Khuẩn lạc mầu đen TSC Nitrit: (+) Lactoza: (+) Hơi: (+) Iron-milk: (+) Gelatin: (+) (+) B Phương pháp nuôi cấy ống thạch B.1 Môi trường thuốc thử - Thạch Wilson Blair hay thạch Perfringens selective đổ vào ống nghiệm ( ống nghiệm khoảng 30ml thạch) - Dung dịch natri sunfit 20% - Dung dịch ferrous amon sunfat 5% (dung dịch phèn sắt 5%) B.2 Tiến hành - Chuẩn bị mẫu dung dịch mẫu thử trên, tùy theo mức độ sạch, bẩn mẫu mà pha loãng đến đậm độ dùng nuôi cấy - Đun chảy thạch Wilson Blair thạch Perfringens selective, để nguội khoảng 500C, cho vào thạch 10ml dung dịch mẫu thử Mỗi nồng độ cấy ống Mỗi ống cho thêm 2ml dung dịch Na 2SO3 20% 5giọt phèn sắt 5% Lắc trộn - Đun cách thủy 750C/15phút Làm đông nhanh thạch - Để 370C/18-24h B.3 Đọc kết quả: Khuẩn lạc vi khuẩn C perfringens trịn, đen, có đường kính ³ 3mm -Tính kết Tính số vi khuẩn có 1g mẫu cách lấy trung bình cộng số khuẩn lạc nghi ngờ C perfringens có hai đĩa thạch ống nghiệm nuôi cấy nồng độ nhân với hệ số pha lỗng tương ứng chia cho 10 Ví dụ: Độ pha loãng 10-2 :  Đĩa thạch ống nghiệm có: 10 khuẩn lạc  Đĩa thạch ống nghiệm có: 14 khuẩn lạc  Số khuẩn lạc có 1g thực phẩm tính X×100=120 Như vậy: Trong gam thực phẩm có 1,2 ´ 10 vi khuẩn C.perfringens  Đồng mẫu Thạch Tryptose – Sunfit – Cycloserin (TSC)  Đổ thạch  Ủ ấm Bình kỵ khí để điều kiện 350C/20-24  Nhận định kết sơ bộ: Chọn đĩa có 20-200 khuẩn lạc đen để đếm  Xác định hình thể, tính chất bắt mầu khả sinh nha bào  Xác định tính chất sinh vật hố học Trực khuẩn ngắn Có nha bào Lactoza: (+) Hơi: (+) Mầu đen môi trường TSC Iron – milk: (+) Làm lỏng gelatin 8.Phương pháp truyền thống- phương pháp đếm khuẩn lạc MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG THUỐC THỬ DÙNG ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG C PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM  Thạch Tryptose - Sulfide - Cycloserine (TSC agar) Tryptose (Difco) 15g Men thủy phân 5g Soyton 5g Sắt ammonium citrat 1g Natri metabisunfit 1g Agar 20g Nước cất 900ml Đun tan môi trường TSC pH = 7,6 ± 0,2 Hấp ướt tới 1210C/15 phút Trước dùng, để môi trường 500C Dung dịch D-cycloserine : Pha 1gam D-cycloserin (tinh thể trắng) vào 200ml nước cất Khử trùng cách lọc bảo quản 40C trước dùng Khi dùng : cho 20 ml dung dịch D-cycloserin vào 250 ml thạch nêu Trộn đổ đĩa Trong trường hợp cần thạch TSC có lịng đỏ trứng gà, sau cho D-cycloserin vào, cho thêm 20 ml dung dịch lòng đỏ trứng gà Trộn đổ đĩa trước dùng  Canh thang thyoglycolat L.cystin 0,5g Agar 0,75 g NaCl 2,5 g Dextroza 5g Men thủy phân 5g Trypton 15 g Natri thioglycolat axit 0,5g thioglycolat Resazurin natri solution(1:1000) 1ml pha Nước cất lít Pha L- cystin, NaCl, dextroza, men thủy phân tryptose lít nước Đun cách thủy cho tan Pha thêm natri thioglycolat axit thioglycolic, pH = 7,1 ± 0,2 Cho thêm dung dịch Natri resazurin, trộn hấp ướt 121 0C/20 phút Có thể san ống nghiệm trước sấy ướt  Môi trường Iron - Milk cải tiến Sữa tươi tồn phần lít Sắt sunfat.7H2O 1g Nước cất 50ml Hòa sắt sunfat vào 50 ml nước cất Cho từ từ lít sữa, vừa cho vừa quấy máy khuấy từ (hoặc đũa thủy tinh) Hút 11ml môi trường vào ống nghiệm 16 x 150 mm Hấp ướt 118 0C/15 phút Môi trường pha chế nên sử dụng  Môi trường lactoza - gelatin Tryptose 15g Men thủy phân 10g Lactoza 10g Đỏ phenol 0,05 g Gelatin 120g Nước cất lít Đun cho tan Tryptose, men thủy phân lactoza 400ml nước Hịa tan gelatin 600ml nước nóng 50 - 600C cho tan Trộn hỗn dịch lại, chỉnh pH đến 7,5 ± 0,2 Cho thêm thị màu đỏ phenol San ống nghiệm 16 x 150mm Hấp ướt 1210C/10phút Trong vòng chưa dùng cần để nóng 50 - 70 0C/ trước tiến hành xét nghiệm  Môi trường canh thang bào tử (Sporulation broth) Polypepton 15g Men thủy phân 3g Starch, soluble 3g MgSO4 khan 0,1g Natri thioglycolat 1g Na2HPO4 11g Nước cất 1lít Chỉnh pH 7,8 ± 0,1 San ống nghiệm Hấp ướt 1210C/15 phút  Mơi trường di động nitrat Cao thịt bị 3g Pepton (Difco) 5g KNO3 1g Na2HPO4 2,5g Thạch 3g Galactoza 5g Glycerin ml Nước cất lít Hịa chất trừ thạch Chỉnh pH 7,3 ± 0,1 Cho thêm thạch đun đến tan San ống 11 ml Hấp ướt 121 0C/15 phút Nếu vịng chưa sử dụng trước tiến hành xét nghiệm phải đun sôi cách thủy 10 phút, sau làm lạnh nước  Dung dịch đệm glycerin muối Glycerin 100ml K2HPO4 12,4g KH2PO4 4g NaCl 4,2g Nước cất 900ml Hòa tan muối NaCl bình có 900ml nước cất Cho glycerin phosphat chỉnh pH=7,2 Hấp ướt 1210C/15phút Trong trường hợp dùng dung dịch glycerin đậm đặc (20%) , cho 200ml glycerin 800ml nước cất 9.Phương pháp phân lập xác định type độc tổ (toxinotype) vi khuẩn clostridium perfringens động vật nhai lại kỹ thuật multiplex pcr  Đặt vấn đề Clostridium perfnngens loại trực khuẩn yếm khí gam dương, gây nhiều bệnh khác người gia súc, gia cầm Đặc tính gây bệnh vi khuẩn liên quan đến loại độc tố chúng sản sinh Alpha, Beta, Epsilon Iota; ngồi cịn độc tố ngoại bào enterotoxin gây bệnh ngộ độc thực phẩm người, Beta toxin gây bệnh viêm ruột hoại tử gia súc, đặc biệt lợn con, ngựa, chó, Hiện xác định C perfringens có type vào khả sản sinh loại độc tố type A B, C, D, E Theo Dwight cộng (2004), tất type sản sinh Alpha toxin, riêng C perfringens type A sản sinh Alpha toxin loại phospholipase C có khả sphingomyeline Cả loại protein kết hợp với màng tế bào vật chủ Beta toxin Cl perfringens type B C sản sinh, nằm plasmid vi khuẩn, gây tổn thương tế bào biểu mô ruột, tế bào màng ruột Ngồi ra, beta toxin cịn tác động đến mơ thần kinh làm ảnh hưởng đến trao đổi calcium màng gây rối loạn chức thần kinh bình thường Mới đây, nhiều tác giả đề cập đến độc tố beta toxin (Cpb2), gene mã hoá nằm plasmid Theo Dawn thuỷ phân phosphotidylcholine Cộng ( 2003 ) Trường đại học Arizona ( Mỹ ) tỷ lệ lưu hành gene Cpb2 chủng Củ perfringens phân lập bò bị bệnh tiêu chảy , bệnh viêm ruột nhiễm độc máu chết đột tử 21,4 % , bê bị bệnh type A 11,8 % , type C 40 % type E 97,3 % Epsilon toxin C perfringens type B D sản sinh , gene mã hóa nằm plasmid Đích độc tố nhóm lipid : Cholesterol sphingolipid có mặt màng tế bào động vật Eukaryotic , , độc tố tập trung não thận Độc tố Ex tiết tiền độc tố kích hoạt men proteolytic Iota toxin C perfringens type E sản sinh , có vị trí : Vị trí gắn độc tố với tế bào biểu mơ đích ( lb ) vị trí hoạt hóa enzyme ( Ia ) Sau độc tố gắn vào thụ thể đặc hiệu bề mặt tế bào , la xâm nhập vào tế bào chất gây chết tế bào Trong ổ dịch viêm ruột tiêu chảy , chủng C perfringens gây bệnh thải tồn thời gian dài đất C perfringens type A gây bệnh viêm ruột tiêu chảy cho gia súc gặp hầu hết quốc gia Type B gây bệnh lý cho cừu Châu Âu Nam Phi , bệnh viêm ruột tiêu chảy cho dê cừu Iran, Type C gây bệnh tiêu chảy cho gia súc nguyên nhân gây bệnh viêm ruột nhiễm độc máu người Type D gây bệnh cho cừu , type E phát Anh , Mỹ , Úc gây bệnh viêm ruột nhiễm độc máu Nhằm đánh giá lưu hành type độc tố vi khuẩn C perfringens phân lập từ bỏ bê dê cừu mắc bệnh tiêu chảy nuôi số tỉnh duyên hải miền Trung , sử dụng kỹ thuật multiplex PCR để định type , từ đề hướng nghiên cứu đồng thời để xuất giải pháp nhằm giảm thiểu thiệt hại chăn nuôi động vật nhai lại , bệnh ngộ độc thực phẩm C perfringens gây người  Nguyên liệu phương pháp: Nguyên liệu: Bệnh phẩm phân , chất chứa đường ruột , phủ tạng bò bê , dê cừu bị tiêu chảy Môi trường gồm : Thioglycolate, egg yolk, TSC, SPS, litmus milk thạch máu hãng Merck Các sinh phẩm dùng cho phản ứng PCR gồm Primers : Sử dụng cặp môi : CPA ( alpha toxin ) , CPB ( beta toxin ) , CPE ( epsilon toxin ), CPI ( iota toxin ) Sigma - genosys ( The Woodlands , TX , USA ) Itaq DNA polymerase units / ul 50ul Biorad Bình ni cấy yếm khí máy luân nhiệt Phương pháp: Phân lập xác định đặc tính sinh vật hố học vi khuẩn C perfringens theo phương pháp Quinn cộng 1998 Xác định type độc tố phản ứng multiplex PCR phát gắn mã hoá cho độc tố alpha , beta , epsilon iota vi khuẩn C perfringens theo phương pháp Han Sang Yoo cộng 1997 Phản ứng multiplex PCR thực máy luân nhiệt Hỗn hợp PCR gồm có : 541 PCR buffer 10x , 4ul 25 mM MgCl2 , 1ul d NTPs 10mM, 100 pmol primers , 1ụl Taq polymerase, nước cất vừa đủ 50ml Chương trình sử dụng : phút 94 °C, 30 chu kỳ : phút 55 °C, phút 72 °C, phút 94 °C  Kết nghiên cứu: Kết phân lập vi khuẩn: a/ Phân lập vi khuẩn C peranngens từ bò , bé bị tiêu chảy : Đã thu thập 223 mẫu phân từ trực tràng bò bé bị tiêu chảy Kết ni cá phân lập trình bày bảng Tỉnh Đắc Lắc Khánh Số mẫu phân lập 132 Số mẫu dương tính 49 Tỷ lệ % 37.12 91 43 47.25 Hòa Tổng cộng 223 92 41.27 Bảng 1: Kết phân lập C perfringens từ bò bê Bảng cho thấy, tỷ lệ phân lập C perfringens từ 223 mẫu phân thu thập lồi bị, bê tiêu chảy 41,27 %, Đắk Lắk 37,12 % Khánh Hoà 47,25 % b/ Phân lập vi khuẩn C perfengens từ dê , cừu bị tiêu chảy : Đã thu thập 67 mẫu phân 20 máu phủ tạng dê , cừu có triệu chứng mắc bệnh tiêu chảy tỉnh Khánh Hoà Ninh Thuận Kết phân lập trình bày bảng Bảng 2: Kết phân lập C perfringens từ dê cừu Bảng cho thấy , tỷ lệ phân lập C perfringens từ 67 mẫu phân thu thập dê cừu tiêu chảy 37,31 % , Ninh Thuận 43,18 % Khánh Hoà 26,08 % Tỷ lệ phân lập C perfringens từ mẫu phủ tạng dê cừu chết bị viêm ruột tiêu chảy 100 %  Kết xác định đặc tính sinh vật hoá học Từ 137 chủng vi khuẩn C perfringens phân lập từ bò , bê , dê , cừu bị bệnh tiêu chảy , tiến hành xác định đặc tính sinh vật hố học theo mơ tả Quinn Cộng 1994 Kết trình bày bảng Bảng 3: Kết xác định đặc tính sinh hóa Các đặc tính sinh vật hoá học 137 chủng vi khuẩn C perfringens phân lập từ bố , be , dê , cừu bị bệnh tiêu chảy phù hợp với đặc tính sinh vật hoá học vi khuẩn C perfringens tài liệu công bố  Kết xác định type độc tố ( toxinotype ) Dùng phản ứng Multiplex PCR để xác định gen mã hoá cho độc tố alpha, beta, epsilon iota 137 chủng vi khuẩn C perfringens Kết tình bày bảng Bảng 4: Type độc tố C perfringens phân lập từ bò, dê, bê, cừu Kết từ bảng cho thấy , 92 chủng C perfringens phân lập từ bò , bê thuộc type A mang gen Cpa quy định sinh tổng hợp độc tố Alpha , tỷ lệ 100 % ; 25 chủng C perfringens phân lập từ phân dê cừu tiêu chảy thuộc type A , 20 chủng phân lập từ phủ tạng dê , cừu bị bệnh viêm ruột tiêu chảy thuộc type D mang gen Cpa Cpe quy định sinh tổng hợp độc tố Alpha , Epsilon , tỷ lệ 100 % Như chủng Cl perfringens phân lập từ dê cừu thuộc type A D Các chủng phân lập có đặc tính sinh vật hoá học vi khuẩn C Perfringens tác giả công bố Những chủng C Perfringens phân lập từ bò , bê tiêu chảy thuộc tupe A mang gen Cpa Những chủng C Perfringens phân lập từ phân dê cừu bị tiêu chảy thuộc type A ; song phân lập từ phủ tạng lại thuộc type A mang gen Cpa Cpe  KẾT LUẬN Kết phân lập C perfringens từ 233 mẫu phân bò phân bê bị tiêu chảy cho ta thấy, tỷ lệ dương tính Đắk Lắk 37,12% ( 49/132 mẫu ), tỉnh Khánh Hoà 47,25 % ( 43/91 mẫu ) Kết phân lập C Perfringens từ 67 mẫu phân 20 mẫu phủ tạng dê , cừu bị tiêu chảy cho thấy, dương tính mẫu phân dê, cừu tỉnh Ninh Thuận 43% (19/44 mẫu ), Khánh Hoà 26,08 % ( 6/23 mẫu ) ; với mẫu phủ tạng dù Ninh Thuận hay Khánh Hoà dương tính 100 % “PCR đa mồi (Multiplex PCR): Đây kiểu PCR sử dụng nhiều cặp mồi khác để khuếch đại trình tự mục tiêu khác mix phản ứng Để thiết kế phản ứng Multiplex PCR đòi hỏi cặp mồi sử dụng phải có nhiệt độ bắt cặp cặp mồi không bắt cặp với hay bắt cặp chéo lẫn Ngoài ra, phải đảm bảo độ nhạy Multiplex PCR tương đương với Simplex PCR, điều khó xảy nên thơng thường multiplex PCR sử dụng tế bào nuôi cấy lúc số lượng trình tự đích đủ lớn khơng địi hỏi q khắt khe độ nhạy.” Sơ đồ quy trình Nested PCR  Dạng cải tiến phản ứng PCR thông thường >2 locus nhân lên phản ứng  Sử dụng cặp mồi chuyên biệt cho gene khác cần phản ứng xác định đồng thời nhiều tác nhân vi sinh vật dựa nguyên lý sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA đích chúng  Để thiết kế Multiplex PCR phải thiết kế mồi có nhiệt độ bắt cặp lên DNA đích, mồi khơng bắt cặp với độ nhạy phát tác nhân đích khơng bị giảm mà tương đương độ nhạy PCR đơn mồi Phương pháp áp dụng thành công nhiều lĩnh vực thí nghiệm DNA: phân tích đoạn, đột biến, đa hình phương pháp định lượng kỹ thuật PCR chép ngược (RT - PCR) 10.Nghiên cứu clostridium perfringens PHƯƠNG PHÁP: Đầu tiên ta lấy mẫu phân lập vi khuẩn Clostridium Perfringens Lấy tổng cộng 124 mẫu chia làm nhóm Nhóm lấy mẫu lợn có độ tuổi từ 1-28 ngày tuổi, nhóm lấy mẫu lợn có độ tuổi từ 29- 90 ngày tuổi Lấy mẫu lợn có biểu nặng rõ rệt để nhận dạng như: mệt mỏi, tiêu chảy, kén ăn, phân lỏng, phân có lẫn máu bốc mùi nặng nhiễm bệnh Mẫu phải lấy trực tiếp trực tràng sau lấy mẫu phải đựng bảo quản hộp đựng mẫu chuyên dụng có nút xoắn điều kiện bảo quản mẫu vòng Mẫu lấy đem thí nghiệm mơi trường nước thạch máu nhiệt độ 37°C vòng 24h xuất khuẩn lạc trơn bóng, trịn , có vùng dung huyết đơi đặc trưng “Tỉ lệ nhiêm Clostridium Perfringens hội chứng tiêu chảy lợn nuôi Hà Nội vùng phụ cận.” KẾT QUẢ : Kết phân lập vi khuẩn Clostridium Perfringens mẫu phân lợn bị tiêu chảy Kết cho thấy phân lập 100% mẫu phân lợn bị tiêu chảy cho biết tỷ lệ trung bình phân lập Clostridium Perfringens phân lợn nghi bị tiêu chảy bệnh viêm ruột hoại tử, gan, lách chiếm cao “Chẩn đoán nhiễm trùng đường ruột Clostridium perfringens cừu dê”  Kết nghiên cứu : phát độc tố C perfringens thành phần ruột nuôi cấy định lượng sau đánh máy gen “Clostridium perfringens nhiễm trùng thực phẩm”  Kết nghiên cứu: mô tả bệnh lây truyền qua thực phẩm C perfringens, tập trung vào nguyên nhân ngộ độc thực phẩm tiêu chảy phổ biến chủng enterotoxin dương tính loại A, viêm ruột hoại tử loại C độc tố liên quan TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Lê Lập, Nguyễn Đức Tân (2006), Phân lập xác định type độc tố (toxinotype) vi khuẩn Clostridium perfringens động vật nhai lại kỹ thuật Multiplex PCR, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thôn 2007, số [2] Phạm Hùng Vân PCR real-time PCR: Các vấn đề ứng dụng thường gặp [3] Hồ Huỳnh Thùy Dương 1997 “Sinh học phân tử” Nhà xuất Giáo dục [4] Trần Linh Thước 2002 “Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm” Nhà xuất Giáo dục [5] https://www.scirp.org/journal/paperinformation.aspx?paperid=100585 [6] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4155746/ [7] https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11522752/ [8] https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0168160595000534 [9] https://www.researchgate.net/profile/MohammadMohammadabadi/publication/320189917_ROLE_OF_CLOSTRIDIUM_PERF RINGENS_IN_PATHOGENICITY_OF_SOME_DOMESTIC_ANIMALS/link s/59d3c0b8aca2721f436cde00/ROLE-OF-CLOSTRIDIUMPERFRINGENS- IN-PATHOGENICITY-OF-SOME-DOMESTICANIMALS.pdf [10] https://www.sigmaaldrich.com/VN/en/technical-documents/technical- article/microbiological-testing/pathogen-and-spoilagetesting/clostridium- perfringens [11] https://www.scielo.br/j/jvatitd/a/KpB696pHSw7kRkMn8NcTzmP/? lang=en ... khuẩn clostridium perfringens động vật nhai lại kỹ thuật multiplex pcr .24 10 Nghiên cứu clostridium perfringens 30 1.Tổng quan clostridium perfringens -Phân loại khoa học Loài C perfringens. ..MỤC LỤC Tổng quan clostridium perfringens 2 Tầm quan trọng việc nghiên cứu đối tượng Clostridium perfringens Dùng kỹ thuật khác để phân tích đối tượng C perfringens .9 Phương pháp... độc tố ruột Clostridium perfringens Độc tố Clostridium perfrigens mục tiêu điều trị cho bệnh ung thư tuyến tụy đề xuất phương thức điều trị cách sử dụng hợp chất CPE (Clostridium perfringens