BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BACILLUS CEREUS TP HỒ CHÍ MINH, 2021 TP HỒ CHÍ MINH, 2021 TP HỒ CHÍ MINH, 2021 BỘ CÔNG.
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BACILLUS CEREUS TP HỒ CHÍ MINH, 2021 TP HỒ CHÍ MINH, 2021 BỘ CƠNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TIỂU LUẬN KỸ THUẬT PHÂN TÍCH BACILLUS CEREUS TP HỒ CHÍ MINH, 2021 PHIẾU GIAO NHIỆM VỤ BẢN NHẬN XÉT CỦA GVHD BẢNG PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ LỜI CAM ĐOAN Chúng em cam đoan đề tài tiểu luận nhóm thực hướng dẫn GVHD Các số liệu kết tiểu luận trung thực, không chép làm nhóm khác TP.HCM, tháng 08 năm 2021 SINH VIÊN THỰC HIỆN TÓM TẮT TIỂU LUẬN Mục đích tiểu luận tìm hiểu kỹ thuật phát vi khuẩn Bacillus cereus thực phẩm Qua giúp nhóm hiểu phương pháp kiểm nghiện vi sinh ứng dụng thực tế Trong đề tài này, nhóm tìm hiểu đặc điểm vi khuẩn Bacillus cereus, nguyên lí bước thực hiện, ưu điểm nhược điểm phương pháp đếm lạc khuẩn, phương pháp MNP phương pháp ELISA sandwich LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tiểu luận này, trước hết chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến GVHD học phần truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu cho chúng em suốt trình học tập rèn luyện trường Trong trình thực đề tài chúng em gặp khơng khó khăn Nhưng với động viên giúp đỡ thầy, chúng em hồn thành tốt đề tài tiểu luận có kinh nghiệm, kiến thức hữu ích cho thân Dù cố gắng tránh khỏi sai sót Rất mong thơng cảm đóng góp ý kiến thầy bạn để tiểu luận hoàn thiện Cuối cùng, xin kính chúc thầy bạn sức khỏe, ln thành công công việc sống Chúng em xin chân thành cảm ơn! TP Hờ Chí Minh, tháng 08, năm 2021 SVTH MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU 10 Bảng 2.8 Hố chất cho thí nghiệm phân tích STT Hoá chất Đệm cacbonat Đệm khoá kép PBS Đệm rửa (PBS-T) Cơ chất TMB Dung dịch chất ngưng Chuẩn bị dung dịch đệm: Vai trị Đệm phủ Tác nhân khố giếng Rửa giếng Phát tín hiệu màu Kết thúc phản ứng Bảng 2.9 Cách pha lỗng dung dịch đệm Chất đệm Đệm cacbonat, nờng độ 50 mm (pH= 9,6) Đệm PBS, nồng độ 10 mm (pH= 7,4) Đệm rửa (PBS-T) Đệm khoá kép Cơ chất TMB Pha loãng chất đệm 1,59 g với 2,93 g 1L nước cất 2,9 g 12, g nacl, 0,2 g KCl 0,2 g 1L nước cất 10 mM muối đệm phosphate (PBS) (pH= 7,4) chứa 0,05% Tween 20 (v/v) 10 mM PBS (pH= 7,4) chứa 0,05% Albumin huyết bò (BSA) (m/v) 0,05% dung dịch sữa bột gầy (m/v) ml đệm Natri Xitrat (pH= 3,6) chứa 10 μl TMB (10 mg/ml) μl (30%) Chuẩn bị kháng nguyên, kháng thể Kỹ thuật ELISA sandwich xác định B cereus cách sử dụng toàn tế bào B cereus làm chất miễn dịch, kháng thể đa dòng (pAb) kháng thể đơn dòng (mAbs) tạo từ kháng huyết thỏ cổ trướng chuột, sử dụng phương pháp kết tủa axit octanoic/amoni sulfat bão hòa cột protein A-sepharose IgG-isotype mAbs phát triển để trải qua trình miễn dịch đa vị trí ngoại vi để tạo u lai nhanh chóng sử dụng hình loại trừ để loại bỏ phản ứng chéo với loài họ hàng Bacillus thuringiensis, B subtilis, B licheniformis B perfringens Một cặp KT phù hợp cần thử nghiệm trước sử dụng Vi khuẩn B cereus trước phân tích cần bảo quản -80°C 30 - Việc chuẩn bị KN bao gờm: tồn KN điều chế 50 mM Tris-HCl, 10 mM Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 100 mM NaCl (pH = 8), ủ 30 phút 37°C, dùng phương pháp siêu âm 150 W (chu kỳ 90, 40 lần) để - chiết xuất KN Chiết xuất KN bề mặt tế bào: KN b1, B cereus cho mM Tris hydrochloride (TRISE), 1% Natri lauryl sulfate (SDS) (wt/vol) mM 2- - mercaptoethanol pH = 9,8, đun nóng đến 70°C để 30 phút KN b2, B cereus cho vào mM Tris hydrochloride (TRISE) 1% (wt/vol) SDS - pH = 8, ủ nhiệt độ phòng 30 phút Đun sôi KN: kháng nguyên đun sôi 10 phút Cố định kháng nguyên formaldehyde (paraformaldehyde): KN cố định 4% formaldehyde 20 phút Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị: Đĩa micrototer 96 giếng (8 hàng-12 cột), pipet (8 đầu tip), máy rửa, máy đọc 2.3.3.4 Các bước tiến hành Bảng 2.10 Quy trình ELISA sandwich Phủ KT bắt giữ - Phủ bề mặt giếng 100 μLKT phát 18μg/mLdd đệm cacbonat đậy kín đĩa ngăn bay - Ủ qua đêm 4˚C để cố định KT - Rửa giếng lần dung dịch PBS-T để loại bỏ dd đệm phủ - Những giọt nước lại giếng loại bỏ cách vỗ nhẹ microtiter khăn giấy Khố thêm mẫu Hình ảnh minh hoạ - Khố vị trí khơng liên kết cịn lại bề mặt, ngăn KN mục tiêu hấp phụ vào giếng - Cho vào giếng 200 μL sữa gầy 0,05% đậy kín, ủ 37°C 90 phút để giảm gắn kết không đặc hiệu KN mục tiêu - Rửa dd khoá giếng 31 Thêm 100 μL dd mẫu chứa KN pha loãng nối tiếp mười lần vào giếng, ủ 37°C 40 phút rửa giếng để loại bỏ KN không liên kết Thêm KT phát hiện, KT cộng hợp enzyme - Thêm vào giếng 100 μL KT phát đơn dịng pha lỗng dung dịch PBS độ pha loãng 1:1000 - Ủ 37˚C 30 phút Mục đích ủ để KN liên kết với KT cố định đĩa - Rửa để loại bỏ KT không liên kết - Thêm vào giếng 100 μL KT cộng hợp gắn enzyme horseradish peroxidase, pha loãng PBS (độ pha loãng 1:5000) Đảm bảo KT phát liên kết vị trí khác kháng nguyên sau KT bắt giữ - Ủ 37°C 30 phút Rửa đĩa sáu lần để liên kết enzymekháng thể không liên kết bị loại bỏ khỏi giếng Thêm chất Thêm vào giếng 100 μL dung dịch chất TMB, ủ 37°C 15 phút Kết thúc phản ứng cách thêm 50 μL dd chất ngưng phản ứng - Đo độ hấp thụ màu bước sóng 450 nm dùng đèn Flash Varioskan quét vào giếng để xác định có mặt số lượng kháng nguyên 2.3.3.5 Kết phân tích 32 - Lập đường chuẩn từ liệu độ pha lỗng nối tiếp với nờng độ trục x (thang log) so với độ hấp thụ trục Y (tuyến tính) Nội suy nờng độ mẫu từ đường - chuẩn Đo độ đục mẫu chuẩn chứa kháng nguyên B.cereus nồng độ khác lặp lại lần đo 15 giếng (Hình 3.1), từ 1× đến 1× tế bào/ml sử dụng để xây dựng đường chuẩn có phương trình y = 0.612x - 1,698 Phạm vi hoạt động thử nghiệm xác định phần đường cong có hệ số tuyến tính > 0,99 Phạm vi tuyến tính phương pháp khoảng từ 1×đến 2,8×tế bào/mL với giới hạn phát 0,9× tế bào/mL Như kết thí nghiệm, B cereus phát trực tiếp nờng độ thấp tới 0,9× tế bào/mL dung dịch đệm - muối phosphat Để đánh giá tính đặc hiệu cơng dụng kỹ thuật ELISA sandwich dựa kháng thể kép, thịt chia nhỏ tẩm mầm bệnh khác phân tích ELISA sandwich Việc thu hời B cereus từ mẫu thịt khoảng từ 94,9% đến 98,4% với giá trị CV (hệ số biến đổi) dao động từ 1,3% đến 7,2% Tóm lại, KT đặc hiệu cao chống lại B cereus sản xuất nhanh chóng hiệu chuột kỹ thuật sàng lọc trừ tiêm chủng nhiều vị trí ngoại vi Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy tuyến tính Chú thích: A: đường chuẩn ELISA sandwich; B: đường tuyến tính bảo tồn từ A, hời quy tuyến tính cho thấy phạm vi hoạt động từ 1× đến 2,8× mL/ơ ( = 0,993), phần bên trái; Trục X: độ hấp thụ bước sóng 450 nm; Trục Y: log Kow nồng độ B cereus 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1.1 Phương pháp đếm lạc khuẩn Phương pháp cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật sống diện mẫu Tế bào sống tế bào có khả phân chia tạo thành khuẩn lạc môi trường chọn lọc Phương pháp đếm khuẩn lạc có đặc điểm cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường điều kiện nuôi cấy Bảng 3.1 Ưu-nhược điểm phương pháp đếm lạc khuẩn Ưu điểm Nhược điểm Một phương pháp tốt Thời gian phân tích lâu để xác đinh mật độ tế bào sống Độ nhạy không cao Ứng dụng rộng rãi kiểm nghiệm Yêu cầu có kỹ thao tác vi sinh vật nước, thực phẩm Không cần phải đầu tư dụng cụ Tốn nhiều nhân công thiết bị đắt tiền Tốn nhiều hóa chất 3.1.2 Phương pháp MPN Thơng qua việc sử dụng kỹ thuật tính số có xác suất lớn – MPN để định lượng mật độ Bacillus cereus có thực phẩm, từ đó, giúp thúc đẩy việc kiểm sốt giảm thiểu mức độ nhiễm vi khuẩn thực phẩm Trên thực tế, độ xác phương pháp tăng lên đáng kể tăng số lần lặp lại thí nghiệm giảm khoảng thời gian loạt pha loãng Tuy nhiên phương pháp có ưu-nhược điểm như: Bảng 3.2 Ưu- nhược điểm phương pháp MPN Ưu điểm Có độ xác cao, độ nhạy nhìn chung đáp ứng đủ cho mục đích thực tiễn Không cần phải đầu tư thiết bị đắt tiền Cho phép định lượng vi sinh có nờng độ nhỏ (