I. PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC ĐỊNH LƯỢNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA
7. Thảo luận, kiến nghị, so sánh phân tích
Phương pháp màng lọc vi sinh (MF) với ưu điểm lớn nhất là phân tích được mật độ vi khuẩn trong một thể tích mẫu lớn.
Kỹ thuật MF là một phương pháp thay thế cho phương pháp số có thể xảy ra nhất. Người ta có thể kiểm tra một lượng lớn mẫu nước thông qua phương pháp lọc milipore.
Lọc màng tiêu tốn ít thời gian hơn so với phương pháp MPN, vì nó chỉ bao gồm bốn đến năm bước để có được kết quả.
Kỹ thuật MF cho kết quả phù hợp và đáng tin cậy hơn so với phương pháp MPN. Người ta có thể thống kê trực tiếp số lượng vi khuẩn có trong mẫu nước bằng cách sử dụng máy đếm khuẩn lạc.
Nhược điểm của PP màng lọc
Phương pháp lọc màng khơng được áp dụng để kiểm tra nước đục.
Có thể có khả năng vi khuẩn phát triển q mức, vì nước có chứa nhiều vi sinh vật.
8. Tổng kết và kiến nghị:
Phương pháp lọc màng là một phương pháp hiệu quả để phân lập và thống kê số lượng vi sinh vật từ mẫu dịch bị nhiễm vi sinh vật. Phương pháp lọc màng xác định quần thể vi sinh vật bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc rời rạc, đây là một ưu điểm so với phương pháp MPN. Khác với phương pháp lọc màng, phương pháp MPN xác định mật độ vi sinh vật dựa trên độ đục của mơi trường ni cấy. Vì vậy nếu cần định lượng
Pseudomonas thì nên sử dụng phương pháp màng lọc thay vì dùng phương pháp MPN
II. PHƯƠNG PHÁP API 20NE.1. Tổng quan: 1. Tổng quan:
API strip cung cấp giải pháp định danh chính xác dựa trên cơ sở dữ liệu lớn và chuẩn hóa; rất dễ sử dụng. Bộ kít với các strips chứa tới 20 xét nghiệm sinh hóa thu nhỏ. Tất cả đều nhanh chóng, an toàn và dễ sử dụng Tiết kiệm để dạy và thân thiện với người dùng, các strips API có thời hạn sử dụng dài, cho phép các phịng thí nghiệm ln có sẵn bộ dụng cụ kiểm tra. [11]
Định danh vi khuẩn bằng kit API 20NE:
Bộ định danh API 20 thường được xác định vi khuẩn Gram âm hay là không phải vi khuẩn. Bên cạnh đó có API-Staph là một hệ thống dùng đánh giá Gram dương.
2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, thuốc thử: [12]2.1. Thiết bị 2.1. Thiết bị
- Tủ ấm 30.
- Máy vi tính và phần mềm ApiwebTM. - Máy đo độ đục Vitek
2.2. Dụng cụ
- Ống thủy tinh vô khuẩn 5ml.
- Bảo hộ lao động: găng tay, khẩu trang, mũ giấy,..
2.3. Hóa chất, thuốc thử
- Thanh API 20NE.
- Nước muối sinh lý (NaCl 0,85%). - Ống API AUX Medium.
- James.
- NIT1 và NIT2. - Parafin
Thanh API 20NE chứa 20 giếng nhỏ (20 cơ chất khác nhau cùng với 20 phản ứng hóa sinh cần xác định trong nước).
Dùng que tiệt trùng để lấy dung dịch vi khuẩn định danh để đưa vào giếng nhỏ sao cho nhiệt độ ủ và thời gian thích hợp. Và ở đó, vi khuẩn sẽ phát triển và làm màu sắc thay đổi hay chúng ta sẽ cần thêm thuốc thử để bổ sung vào giếng nhỏ xem thử đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn.
3. Cách tiến hành: [13]
- Chuẩn bị dung dịch NaCl 0,85% ( đã có 2ml huyền dịch vi khuẩn) có độ đục đạt 0,5 McFarland.
- Nhỏ 5ml nước cất tiệt trùng hay nước muối sinh lý vào đáy khay, ghi mã số trên từng khay. Đưa bao ngoài đi xét nghiệm, rồi cho vào khay ủ.
- Dùng cùng 1 pipet đã tiệt trùng hút dung dịch huyền dịch vi khuẩn cho vào mỗi ô của bộ kít. Nhỏ huyền dịch vi khuẩn vừa đủ đến 1/2 giếng của tất cả các giếng , TRP, PNPG, ADH, GLU, GEL, URE, ESC đặc biệt tránh tạo bọt. Và các giếng GLU, ADH, URE cho thêm Parafin tiệt trùng để tạo điều kiện yếm khí ( cho đến đầy giếng).
- Mở nắp API AUX Medium để cho 200 huyền dịch vi khuẩn vào trộn đều và sử dụng cùng 1 pipet nhỏ vào các giếng còn lại, chú ý là nhỏ đầy phồng mặt giếng hoặc bằng mặt giếng ( nhỏ ít quá hoặc tràn sẽ dẫn đến sai kết quả), tránh tạo bọt trong các giếng.
- Đến cuối đậy nắp nộp, ủ 30 1 trong vòng 24 giờ.
4. Bổ sung thêm thuốc thử và đọc kết quả:
- Giếng chứa phải nhỏ thêm 1 giọt NIT1 và 1 giọt NIT2 và đợi sau 5 phút, kết quả dương tính thì dịch sẽ có màu đỏ ( đã được vi khuẩn chuyển hóa thành ), thêm 2- 3mg bột kẽm nếu dịch khơng chuyển màu, đợi 5 phút. Nếu vẫn không chuyển màu là dương tính, quan sát thấy trong giếng tạo ra bọt khí ( đã được vi khuẩn chuyển hóa thành và hơi thốt ra)
- Nếu dịch trong giếng chuyển màu đỏ, giếng chứa âm tính.
- Giếng TRP phải nhỏ thêm 1 giọt James và đợi 5 phút, kết quả dương tính khi trong giếng chuyển sang màu hồng và ngược lại khơng đổi màu thì âm tính.
- Các test đồng hóa ( từ giếng GLU tới PNPG) quan sát ApiwebTM ( bảng màu tiêu chuẩn trong phần mềm) để phát hiện ra dương tính hay âm tính.
- Các giếng cịn lại ( nhỏ phồng) dương tính khi bề mặt thấy đục, cịn khơng thấy đục thì âm tính.
Qua các kết qủa trên, nếu chưa phân biệt rõ nhất là các test nhỏ phồng thì phải ủ 30 1 trong vịng 24 giờ ( trừ 3 giếng đầu tiên không được quá 48 giờ, bắt buộc trong 24 giờ).
- Sau khi đã xác nhận được các kết quả kiểm tra thì hãy sử dụng phần mềm ApiwebTM để nhận biết được các mẫu.
Bảng 4: Đọc kết quả của các phản ứng sinh hóa của kít API 20NE
9. Kết quả :
Bên cạnh việc phát hiện sự tạo sắc tố huỳnh quang từ ánh sáng dưới đèn UV phương pháp sử dụng bộ kít API 20NE cũng phù hợp cho việc xác định và định danh các đặc điểm sinh hóa chính của các chủng vi khuẩn qua xét nghiệm. Và được chứng minh ở hình 5.1.
Hình 5.1. Test API 20NE xác định tính chất sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu xét nghiệm ( mẫu 15, mẫu 46 )
Và việc định danh bằng kít API 20NE của các vi khuẩn phân lập dương tính từ các mẫu nước. Có thể thấy kết quả sau đây ( bảng 5.2)
Bảng 5.2: Kết quả test thử sinh hóa API 20NE đối với một số chủng vi khuẩn phân lập trong mẫu nghiên cứu sau 24h nuôi cấy
10. Nhận xét:
- Phản ứng dương tính gồm: , ADH, GEL, GLU, MAN, GNT, CAP, MLT, CIT.
- Thu được kết quả, định danh kít API 20NE kết hợp với hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey, các vi khuẩn phân lập được xác định đó là Pseudomonas aeruginosa với ID 99,6% ( độ tương đồng).
- Ngồi ra cịn sử dụng test SAS của Pháp để kiểm tra phản ứng oxidase. Và các kết quả đó đều cho kết quả dương tính.
11. Kết quả nghiên cứu:
Kít này có nguồn gốc từ động vật và đảm bảo khơng bị lây nhiễm các mầm bệnh. Tuy nhiên các sản phẩm này vẫn phải được xử lý như một nguồn lây nhiễm tiềm ẩn. Tất cả các bệnh phẩm nuôi cấy vi khuẩn và các sản phẩm liên quan phải được xử lý như là nguồn lây nhiễm.
Phương pháp API 20NE này được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau chứ không chuyên biệt một lĩnh vực nào nên có thể sử dụng trong cả tham chiếu, sử dụng để định danh vi khuẩn trong thực phẩm sử dụng hằng ngày hoặc sử dụng trong những buổi học giảng dạy về vi sinh vật, phương pháp test nhanh định danh vi khuẩn trong học tập. [9]
12. Thảo luận, kiến nghị:
Việc định danh vi khuẩn luôn sử dụng các phương pháp truyền thống để đảm bảo độ chính xác cao, nhưng việc này tốn nhiều thời gian và cơng sức. Đó là khi phương pháp API 20NE trở thành sự lựa chọn mới, không chỉ nhanh chóng, tiện lợi mà vẫn đảm bảo độ chính xác như các phương pháp chẩn đoán truyền thống.
Ưu điểm:
- Đến từ một thương hiệu nổi tiếng. Bộ API 20NE được sản xuất bởi công ty BioMerieux của Pháp.
- Kiểm tra rất tiết kiệm chi phí. Do phần mềm tiếng Việt được dịch trực tiếp trên máy nên dễ sử dụng và phù hợp với nhiều kỹ thuật viên nên bạn sẽ không gặp q nhiều khó khăn trong q trình đọc và phân tích kết quả nhận dạng. Bộ sản phẩm rất nhỏ gọn. Nó có thể xác định tới 2000 lồi vi khuẩn trong thực phẩm. Kết quả được đọc khá nhanh.
- Thiết kế thông minh: Được hỗ trợ bởi phần mềm trang web trực tuyến WEB API cực kỳ thông minh.
Nhược điểm:
- Kết quả có thể khác nhau tùy ở mỗi người
- Chỉ xác định các lồi đã có trong cơ sở dữ liệu API - Việc diễn giải có thể trở nên khó khăn ở một số cấp độ
III. PHÂN LẬP CHỦNG PSEUDOMONAS AERUGINOSA SINH HOẠT CHẤT KHÁNG KHUẨN PYOCYANIN
1. Tổng quan các phương pháp nghiên cứu:1.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn 1.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn
Mục đích của việc phân lập là tách vi khuẩn ra khỏi quần thể ban đầu và tạo dòng thuần để điều tra và định danh. Khi vi khuẩn sinh trưởng và phát triển trên bề mặt mơi trường đặc sẽ hình thành các khuẩn lạc, hình thái khuẩn lạc là đặc điểm của từng chủng vi khuẩn. Việc xác định đặc điểm chính xác của các khuẩn lạc phân lập là rất quan trọng trong việc xác định vi khuẩn.
Trong q trình ni cấy vi sinh vật, cần tránh đưa thêm vi sinh vật lạ vào mơi trường. Để đạt được điều này, ngồi các thao tác luôn phải thực hiện trong điều kiện vô trùng,
tất cả các yếu tố từ môi trường, vật chứa, dụng cụ nuôi cấy và các vật dụng cần thiết khác phải được tiệt trùng đúng cách để đạt được độ vô trùng. Khử trùng trước khi sử dụng.
1.2. Phương pháp PCR
Phương pháp PCR: Phản ứng dây chuyền do tác động của DNA polymerase do K. Mulis và cộng sự phát minh năm 1985, đã mang lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử.
Đây là một phương pháp hoàn tồn mới để nghiên cứu và phân tích gen và bộ gen. Khó khăn lớn nhất trong việc phân tích gen trước đây là chúng là những mục tiêu đơn lẻ và rất nhỏ trong một bộ gen cực kỳ phức tạp. Sự ra đời của PCR đã thay đổi mọi thứ và giúp nó có thể sao chép một lượng lớn các đoạn DNA cần thiết.
Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng hoạt động của DNA-polymerase để tạo ra một số lượng lớn các đoạn DNA cụ thể từ DNA khuôn mẫu để tổng hợp các sợi bổ sung mới.
1.3. Phương pháp Định Danh API theo Kit 20NE
Chỉ số phân tích tiểu sử hoặc API dựa trên phân loại vi khuẩn thực nghiệm, có thể nhanh chóng xác định thơng tin vi khuẩn. Hệ thống này được phát triển để xác định nhanh chóng các vi khuẩn có liên quan đến lâm sàng.
Hiện tại, hệ thống thiết bị kiểm tra API do BioMérieux của Pháp sản xuất. Loạt API đã phát triển hai phiên bản, một phiên bản tiêu chuẩn hóa chung và một phiên bản nâng cao rất khó đánh giá.
Bộ nhận dạng API 20 kết hợp một số thử nghiệm phổ biến để xác định các đối tượng là vi khuẩn gram âm hay khơng phải thể thực khuẩn. Ngồi ra, có một hệ thống API cụ thể khác để đánh giá vi khuẩn Gram dương, được gọi là API-Staph.
1.4. Phương pháp tách chiếc cơ học (Ly Tâm)
Mục đích của q trình tách cơ học là phá hủy tế bào, giải phóng các chất có trong tế bào, đảm bảo hoạt động của các enzym trong tế bào.
Vi sinh vật là những sinh vật đơn bào, khi nuôi trong môi trường nuôi cấy, đặc biệt là môi trường lỏng chứa nhiều cơ chất thủy phân sẽ tạo ra nhiều enzym ngoại bào tương ứng. Các enzym ngoại bào này được hịa tan trong mơi trường ni cấy và có thể dễ dàng tách ra khỏi môi trường nuôi cấy.
Các phương pháp cơ học được sử dụng phổ biến nhất để tách enzym khỏi tế bào và các thành phần khác bao gồm hai phương pháp:
Phương pháp ly tâm
Ly tâm là quá trình tách chất rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ enzym, phương pháp ly tâm thường được sử dụng rộng rãi để thu được dung dịch enzym có chứa enzym ngoại bào. Enzym nội bào nằm trong tế bào vi sinh vật, để có được enzim nội bào phải trải qua giai đoạn phá vỡ tế bào. Hầu hết các enzym ngoại bào (exoenzyme) là các enzym hịa tan. Do đó, trong q trình tách ly tâm, dung dịch tách ra khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzym thô, dung dịch enzym thô này cũng chứa các thành phần sau:
Protein hoạt tính sinh học
Các chất tan khác
Nước
2. Nguyên liệu:
Mẫu nước nuôi trồng thủy sản, mẫu tôm, cá được lấy từ Quảng Ninh, Ninh Bình và Nam Định.
Các chủng vi khuẩn thuộc giống Vibrio. Tuyển tập Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Tái sinh Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nguyên liệu và môi trường nuôi cấy vi khuẩn King A, King B sử dụng nhãn hiệu Sigma, Invitrogen ...
Hóa chất dùng trong sinh học phân tử đạt tiêu chuẩn nghiên cứu và có nguồn gốc từ máy ThermoScience, Invitrogen và PCR (Eppendorf-USA), điện di (Mupid R 2plus- Japan), máy quét gel (UV). Transilluminator, Wealtec, Đài Loan.
3. Cách thực hiện phương pháp:3.1. Phân lập vi khuẩn 3.1. Phân lập vi khuẩn
Đồng nhất kỹ nước nuôi thủy sản và đường tiêu hóa rồi pha lỗng đến các nồng độ 10- 3, 10-4 và 10-5, bơi 0,1 ml dịch pha lỗng lên đĩa thạch King A và ủ ở 30oC. Sau 24 giờ, quan sát chọn lọc những khuẩn lạc có màu xanh lam, màu của môi trường chuyển sang xanh lục, tiến hành các thí nghiệm sàng lọc tiếp theo để sàng lọc ra các chủng thuần chủng. Các chủng này được nuôi trên môi trường thạch King B để quan sát huỳnh quang và môi trường lỏng King A để kiểm tra sự tiết pyocyanin.
3.2. Xác định các gen đặc trưng cho loài Pseudomonas aeruginosa
Các cặp mồi PA-F và PA-R: PA-F: 5'-GGGGATCTTCGGACCTCA-3 '; PA-R: 5'- TCCTTAGAGTGCCCACCCG-3' là cụ thể (Spilker và cộng sự, 2004) và có thể được sử dụng trong vi khuẩn nghiên cứu Đoạn gen PA 956 bp được khuếch đại trong dịng có độ đặc hiệu và độ nhạy 100% đối với Pseudomonas aeruginosa. Chu kỳ nhiệt của phản ứng bao gồm 94oC-5 phút; 35 chu kỳ (94oC-30s; 58oC-30s; 72oC-45s) và hoàn thành phản ứng ở 4oC. Kiểm tra sản phẩm PCR trong gel agarose 1,5%, đệm TAE 1X.
3.3. Định danh vi khuẩn (theo Kit 20NE cho vi khuẩn Gram)
Phương pháp được thực hiện được dựa trên hướng dẫn của nhà sản xuất API 20NE kit (BioMérieux, Pháp), và tóm tắt như sau: 18-24 giờ sau, lấy 2 khuẩn lạc từ đĩa nuôi cấy, thêm 4ml nước muối 0,9%, khử trùng; khuấy đều để tránh làm hỏng tiên và tiêm mao, không tạo bọt. Môi trường vi khuẩn này được thêm vào các phản ứng đã có trước bằng
cách dùng pipet. Các phản ứng vi hiếu khí GLU, ADH và URE yêu cầu bổ sung dầu khống và các phản ứng hiếu khí GLU, ARA, MNE, MAN, NAG, MAL, GNT, CAP, ADI , MLT, CIT và PAC thả chất lỏng vi khuẩn dưới đầu giếng (không đổ chất lỏng). Ủ mẫu trong khay đã làm ẩm ở 30oC trong 24 giờ và đọc kết quả.
3.4. Phương pháp tách chiếc xác định hàm lượng PYO (Essar, 1990)
Ly tâm dung dịch ni cấy vi khuẩn ở tốc độ 5000 vịng / phút trong 10 phút, thu lấy phần nổi phía trên, loại bỏ tế bào, thêm cloroform theo tỷ lệ thể tích 1: 2 (1 dung dịch: 2 cloroform), lắc đều, để yên trong 15 phút, lấy ra nổi phía trên, và thu lấy cloroform xanh lam có chứa PYO Floor. Sau đó thêm HCl 0,2M để axit hóa theo tỉ lệ thể tích 1: 1, lắc kỹ, dung dịch chuyển sang màu đỏ. Pha lỗng phép đo OD ở bước sóng 520 nm để xác định nồng độ của hoạt chất. Hàm lượng PYO được xác định theo cơng thức sau: PYO (µg / ml) = OD520 x Độ pha loãng x 17,072.
4. Kết quả nghiên cứu:
4.1. Phân lập vi khuẩn và đặc điểm hình thái của PYO. Các chủng Pseudomonas