V. ĐỊNH DANH CHỦNG ĐỐI KHÁNG CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA
2. Phương pháp phân lập và định danh các chủng visinh vật có thể chống lại bệnh
bệnh thối củ hành tím do vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa:
Đối tượng nghiên cứu:
- Các chủng vi khuẩn đối kháng trong đất có khả năng phịng trị bệnh thối củ hành tím do vi khuẩn P. aeruginosa .
- Chủng vi khuẩn P. aegurinosa được cung cấp bởi Nhóm Nghiên cứu Bệnh cây thuộc Phịng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
- Hành tím giống và hành tím địa phương được Chi cục Bảo vệ Thực vật tỉnh Sóc Trăng cung cấp.
3. Phương pháp phân lập các vi khuẩn trong đất trong hành tím:
Thu thập các mẫu đất ở ruộng trồng củ hành tím khơng bị nhiễm bệnh ở vùng hoặc mẫu đất bị nhiễm bệnh ít. Ở mỗi ruộng trồng, ta sẽ thu mẫu đất ở 9 điểm có độ sâu từ 0 - 20 cm theo đường chéo góc và trộn đều và bỏ vào túi nhựa. Sử dụng 10g mẫu đất và 90 mL nước cất vô trùng và lắc đều trong 30 phút trên máy lắc ngang. Sau đó pha lỗng dung dịch 1000 lần với nước cất vơ trùng và trải đều 50 µL lên mơi trường trường nutrient agar (NA) [5 g peptone, 3 g beef extract, 5 g NaCl, 20 g agar, thêm nước cất vừa đủ 1.000 mL, pH 6,8]. Sau khi nuôi cấy 48 giờ, chọn lọc các khuẩn lạc vi khuẩn có hình thái khác nhau nằm trên bề mặt môi trường nuitrient agar mới cho đến khi ròng. Các chủng vi khuẩn này được bảo quản trọng dung dịch glycerol 15% để sử dụng cho việc ngiên cứu sau.
3.1. Khảo sát mức độ đối kháng của vi khuẩn phân lập trong đất đối với
Pseudomonas aeruginosa trên đĩa thạch
Trải đều 50 µL huyền phù vi khuẩn P.aeruginosa (đươc ni cấy 48 giờ, với mật số 109 CFU/mL) lên đĩa môi trường NA. Tiếp theo chấm sinh khối khuẩn lạc vi khuẩn phân lập (được nuôi cấy 48 giờ trên đĩa thạch NA) lên đĩa NA mới tại 3 điểm cách đều nhau, và ủ ở nhiệt độ 28±2oC ở trong tủ ủ 48 giờ. Việc này được lặp lại 3 lần trên 3 đĩa khác nhau cho mỗi chủng vi khuẩn phân lập khác nhau. Sau khi ủ, lựa chọn các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng và đo bán kính vịng vơ khuẩn. Bảo quản các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng để nghiên cúu các thí nghiệm sau
3.2. Khảo sát khả năng ức chế được vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa của dịch nuôi cấy vi khuẩn đối kháng
Sử dụng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa được nuôi cấy đặt trên đĩa môi trường và tạo 4 giếng (đường kính 6 mm) cách đều và đối xứng bằng ống đục vô trùng. Đánh số các giếng theo chiều kim đồng hồ từ 1 - 4. Các chủng vi khuẩn đối kháng nuôi cấy trong 10 mL môi trường nutrient broth (NB). Ở các thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày sau khi nuôi cấy, đem 1 mL vi khuẩn dạng huyền phù và ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút để được dịch ni cấy khơng cịn các tế bào vi; lấy 20 µL dịch ni cấy
cho vào giếng 1 và 3; sau đó lấy 20 µL mơi trường NB cho vào giếng 4 và ở giếng 2 cho 20 µL nước cất thanh trùng và ủ ở nhiệt độ 28±2oC trong tủ ủ 48 giờ. Mỗi loại chủng vi khuẩn lặp lại 3 lần trên 3 đĩa khác nhau. Quan sát khả năng tạo vịng vơ khuẩn của dịch ni cấy và đo bán kính vịng vơ khuẩn.
3.3. Khảo sát khả năng chống lại bệnh thối củ hành tím của vi khuẩn đối khángtrong nhà lưới trong nhà lưới
Thí nghiệm được thực hiện theo hồn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại gồm 3 nhân tố (1) chủng vi khuẩn đối kháng được tuyển chọn nuôi cấy ở trên phần 1.1 và 1.2, (2) mật số vi khuẩn đối kháng (109, 108 và 107 CFU/mL) và (3) phương pháp xử lý vi khuẩn đối kháng. Nghiệm thức đối chứng âm được xử lý với nước cất thanh trùng và nghiệm thức đối chứng dương được xử lý với thuốc hóa học Starner 20WP 1%.
Đất phù sa trồng hành tím được phơi khơ, băm nhỏ, xử lý phèn bằng vôi bột. Tiếp theo , trộn tỉ lệ 3:1:2 đất: trấu: cát theo khối lượng, Sử dụng chậu nhựa (25x17cm) cho hỗn hợp đất và tưới nước làm mềm đất. Củ hành tím giống tách 1 lớp vỏ bên ngồi và dùng ethanol 70%, ủ với trấu ẩm cho ra rễ trước khi đem trồng vào chậu (10 củ/chậu).
Củ hành tím được gieo bệnh bằng cách tạo vết thương khoảng 5mm xung quanh cổ củ và tiêm 500 µL huyền phù vi khuẩn P. aegurinosa (mật số109 CFU/mL) trong thời điểm 30 ngày sau khi gieo trồng. Tiến hành ghi nhận phần trăm mức độ nhiễm bệnh (tỉ lệ thể tích củ nhiễm bệnh/tổng thể tích củ của mỗi củ hành) trong 4, 8 và 12 ngày sau chủng bệnh. [19]
4. Định danh vi khuẩn đối kháng:
Vi khuẩn đối kháng được định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp với Hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey’s. [20]
5. Xử lý số liệu:
Các số liệu thu thập được phân tích phương sai ANOVA bằng phần mềm SPSS 20, sự khác biệt giữa các nghiệm thức được so sánh bằng kiểm định Duncan ở độ tin cậy 95%.
6. Kết quả:
6.1. Khả năng đối kháng của huyền phù và dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn phânlập từ đất lập từ đất
Hiện có tổng số 133 chủng được phân lập từ bốn mẫu đất trồng hành tím. Loại chủng vi khuẩn có hình dạng khuẩn lạc phổ biến là trịn, rìa có khía hoặc khơng khía, màu trắng trong hoặc trắng đục, kích thước khơng đồng đều. Trong các chủng vi khuẩn được phân lập, 4 chủng vi khuẩn (2C, 3A, 3B và 4A) sở hữu khả năng đối kháng cao với vi khuẩn P. aeruginosa. Chủng 3B có khả năng đối kháng cao nhất (bán kính vịng vơ khuẩn = 6 mm). Ở thí nghiệm khảo sát về khả năng ức chế mầm bệnh thối củ bằng dịch tế bào dịch nuôi cấy của hai chủng 2C và 4A có khả năng ức chế vi khuẩn P. aeruginosa với bán kính vịng vơ khuẩn lần lượt là 5,6 mm và 6,0 mm tại thời điểm sau 48 giờ nuôi cấy. Nhưng, khả năng ức chế mầm bệnh của dịch nuôi cấy sẽ biến mất đi
sau 4 ngày nuôi cấy. Dựa vào kết quả kiểm nghiệm, có hai chủng vi khuẩn 3B và 4A đạt điều kiện để khảo sát khả năng làm giảm bệnh thối củ trong điều kiện nhà lưới. [21]
6.2. Hiệu quả giảm bệnh của các chủng vi khuẩn đối kháng trong điều kiện nhàlưới lưới
Kết quả khảo sát hiệu quả giảm bệnh thối củ hành tím do vi khuẩn P. aegurinosa của
hai chủng vi khuẩn 4A và 3B trong điều kiện nhà lưới được trình bày ở Bảng 1. Trong đó, áo củ với chủng vi khuẩn 3B đạt hiệu quả giảm bệnh cao nhất ở mật số 108 CFU/mL. Trong tất cả các kiểm nghiệm chủng vi khuẩn bằng phương pháp áo củ, hiệu quả giảm bệnh kéo dài đến thời điểm 12 NSCB chỉ riêng nghiệm thức áo củ với chủng vi khuẩn 4A ở mật số 107 CFU/mL thì cho hiệu quả giảm bệnh tại thời điểm 8 NSCB. Còn đối với phương pháp chủng vi khuẩn đối kháng vào đất, kết quả nghiệm thức với chủng vi khuẩn 3B ở mật số 109 CFU/mL cho hiệu quả giảm bệnh cao nhất đến 12 NSCB với mức độ bệnh thối củ là 49,33%. Mặc dù ở nghiệm thức này mức độ bệnh còn cao hơn so với nghiệm thức đối chứng dương (1,67%), nhưng thấp hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng âm (98,33%). Theo một số tiêu chí đề ra gồm hiệu quả giảm bệnh cao và kéo dài cùng với mật số huyền phù vi khuẩn thấp, các nghiệm thức áo củ với chủng 4A và 3B ở mật số 108 CFU/mL và chủng vào đất với 4A ở mật số 108 CFU/mL và 3B ở mật số 109 CFU/mL có tiềm năng cao nhất đã được tuyển chọn để nghiên cứu khả năng phịng trị bệnh thối củ hành tím do vi khuẩn P. aegurinosa trong điều kiện ngồi ruộng đất.
Các số có giá trị trung bình trong cùng thời điểm khảo sát theo sau bởi 1 hoặc các chữ cái giống nhau thì khác biệt khơng ý nghĩa mức ở mức 5% bằng phép thử Duncan. NSCB: ngày sau chủng bệnh
6.3. Định danh vi khuẩn đối kháng
Trình tự mã gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn 4A và 3B so sánh với trình tự gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn khác trên cơ sở dữ liệu GenBank (NCBI). Sau khi khảo sát trình tự gen của chủng 3B có độ tương đồng 99% với trình tự gen của 7 lồi trong chi Bacillus và trình tự gen của chủng 4A có độ tương đồng 99% với trình tự gen của 5 lồi vi khuẩn trong chi Bacillus. Vì giống nhau độ tương, hai chủng vi khuẩn tiếp tục được kiểm nghiệm các đặc điểm sinh lý sinh hóa để xác định tên lồi.
Chủng vi khuẩn 3B
Bacillus aerius (KY818962.1) B.aerophilus (KC172020.1) B. altitudinis (KC172026.1) B. pumilus (KY621522.1) B. safensis (KR063199.1) B. stratosphericus (KC172037.1) B. subtilis (JQ039972.1) Chủng vi khuẩn 4A B. aerius (KR708841.1) B. aerophilus (KY124216.1) B. altitudinis (KU955326.1) B. pumilus (KU962124.1) B. stratosphericus (KT986099.1)
Chủng vi khuẩn 3B là vi khuẩn Gram dương, dạng hình que (Hình 1A),vi sinh vật hiếu khí (phát triển được trên bề mặt mơi trường thạch), có khả năng sinh nội bào tử (Hình 1B) và di động (Hình 1C), tổng hợp được enzyme catalase (Hình 1D), khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ 45o C (Hình 1E) và khơng có khả năng phân giải tinh bột (Hình 1F). Nên, chủng 3B được xác định là vi khuẩn B. safensis.
Hình 1. Chủng vi khuẩn 3B những đặc tính, sinh lý và sinh hóa
A: Gram dương; B: Sinh nội bào tử; C: Di động (+); D: Tổng hợp enzyme catalase (+); E: Phát triển ở 45oC (+); F: Không phân giải tinh bột (-)
Còn chủng vi khuẩn 4A là vi khuẩn Gram dương, dạng hình que (Hình 2A), vi sinh vật hiếu khí (sinh trưởng trên bề mặt mơi trường thạch), có khả năng sinh nội bào tử (Hình 2B) và di động (Hình 2D), tổng hợp được enzyme catalase (Hình 2C), khơng thể phát triển được ở nhiệt độ 45o C (Hình 2E), mẫn cảm với kháng sinh ampicillin (Hình 1F) nhưng khơng mẫn cảm với lincomycin (Hình 2G). Nên, chủng 4A được xác định là vi khuẩn B. stratosphericus.
Hình 2.Chủng vi khuẩn 4A những đặc tính, sinh lý và sinh hóa
A: Gram dương; B: Sinh nội bào tử; C: Tổng hợp enzyme catalase (+); D: Di động (+); E: Không phát triển ở nhiệt độ 45oC (-); F: Mẫn cảm với ampicillin (+); G: Không mẫn cảm với lincomycin (-)
7. Thảo luận:
Kết quả nghiên cứu , có hai chủng vi khuẩn 4A và 3B được định danh bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA, điểm hạn chế của kỹ thuật này là không thể phân biệt các chủng vi khuẩn trong cùng phân nhóm khi chúng có độ tương đồng cao hoặc giống nhau về trình tự gen 16S rRNA. Xét thấy trình tự gen 16S rRNA của 2 chủng 3B và 4A cho thấy cả hai cùng độ tương đồng (99%) với 12 loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Nhưng ta không thể xác định được tên loài của 2 chủng 3B và 4A nếu chỉ dựa vào độ tương đồng. Ngoài ra, sử dụng độ tương đồng cao để định danh chủng vi khuẩn sẽ thể hiện kết quả khơng chính xác và khơng đáng tin cậy vì gen 16S rRNA chỉ chiếm một phần nhỏ trong bộ gen vi sinh vật. Nên, bổ sung các kiểm nghiệm dựa trên sự khác nhau về đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn vào phương pháp định danh là điều cần thiết, đạt kết quả định danh được chính xác và đáng tin cậy hơn. Bằng cách kết hợp phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA với kiểm nghiệm sinh lý, sinh hóa theo Hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey’s, chủng 3B được định danh là vi khuẩn B.
safensis và chủng 4A là vi khuẩn B. stratosphericus.
Vi khuẩn B. safensis được coi là tác nhân phịng trừ sinh học hữu ích trong canh tác nông nghiệp theo hướng bền vững. Hiện nay, chưa có các bài báo cáo nói về khả năng gây hại đến môi trường, con người, động vật và cây trồng của hai lồi vi khuẩn này. Vì vậy, hai chủng vi khuẩn B. stratosphericus 4A và B. safensis 3B có tiềm năng ứng dụng phịng trừ sinh học bệnh thối củ hành tím trong điều kiện ngồi đồng.
8. Kết luận:
Ta có 4 chủng vi khuẩn (2C, 3A, 3B và 4A) có khả năng đối kháng với vi khuẩn P.
aeruginosa trên đĩa thạch, chủng 3B có khả năng đối kháng mạnh nhất (bán kính vịng
vơ khuẩn = 6 mm). Cịn dịch ni cấy của chủng 4A đạt hiệu quả ức chế cao nhất (bán kính vịng vơ khuẩn = 6 mm). Trong điều kiện nhà lưới, áo củ với chủng 4A và 3B (ở mật độ 108 CFU/mL) và chủng trong đất với chủng 4A (108 CFU/mL) và chủng 3B (109 CFU/mL) cho kết quả giảm bệnh cao nhất và kéo dài đến điểm 12 NSCB. Phương
pháp định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp với khảo sát các đặc điểm hình thái và sinh hóa có kết quả là vi khuẩn chủng 3B là B. safensis và
chủng 4A là B. stratosphericus.
Kết quả đóng góp của phương pháp nghiên cứu
Xác định chủng vi khuẩn đối kháng có khả năng chống lại thối củ hành tím do vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa được định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp với hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey’s là vi khuẩn B.
safensis và chủng 4A là vi khuẩn B. stratosphericus.
Phương pháp nghiên cứu đóng góp nên nền tảng cơ sở xác định được các chủng loại vi khuẩn có khả năng chống lại bệnh tật của các giống cây trồng nông nghiệp.
9. Thảo luận kiến nghị:
Bệnh thối củ do vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa gây ra là một trong những bệnh gây thiệt hại năng suất và chất lượng hành tím. Việc phịng chống bệnh bằng việc sử dụng thuốc hóa học là biện pháp phổ biến để phịng trị bệnh thối củ trên hành tím. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học sẽ ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người, gây ô nhiễm mơi trường, tăng chi phí sản xuất và chỉ có khả năng trị bệnh trong giai đoạn bệnh đã phát triển, đồng thời làm tăng khả năng kháng thuốc của mầm bệnh. Phòng trừ sinh học bệnh cây bằng vi khuẩn đối kháng với mầm bệnh được xem là biện pháp hiệu quả và bền vững, thân thiện với mơi trường và an tồn cho sức khỏe con người. Bên cạnh, khả năng đối kháng trực tiếp với mầm bệnh, vi khuẩn đối kháng cịn có khả năng nhân mật số nhanh, kích thích sinh trưởng và tính kháng bệnh của cây trồng, và sử dụng vi khuẩn đối kháng trong đất có nguồn gốc bản địa là hướng phòng trừ bệnh cây tiềm năng và cho kết quả cao trong phòng trị bệnh trên nhiều loại cây trồng. Nghiên cứu này được hiện nhằm phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn đối kháng trong đất có khả năng phịng trị bệnh thối củ hành tím do vi khuẩn P. aeruginosa gây ra và đạt kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp với khảo sát các đặc điểm hình thái và sinh hóa của vi khuẩn cho thấy chủng 3B là Bacillus safensis và chủng 4A là Bacillus stratosphericus.
Giải trình tự gen 16S rRNA được coi là tiêu chuẩn vàng để xác định vi khuẩn. Trình tự so sánh của gen 16S ribosome RNA (rRNA) ở vi khuẩn đã được chứng minh là phương pháp chính xác nhất và có thể tái tạo để xác định các sinh vật chưa biết.
Hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey’s có những ưu điểm giúp cho phương pháp nghiên cứu được dễ dàng hơn để xác định chủng vi khuẩn bằng cách sử dụng các tính chất và đặc tính sinh ly, sinh hóa (hình dạng, nội bào tử, nhuộm Gram, vận động, các thuộc tính enzyme khác nhau) và bất kỳ loại thơng tin nào khác có thể phục vụ để phân định một sinh vật của nhóm sinh vật.
Để phát triển về biện pháp phòng trừ sinh học để chống lại các bệnh hại của cây trồng của ngành nông nghiệp ứng dụng phương pháp định danh phân lập bằng kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp với hệ thống phân loại vi khuẩn
Bergey’s để tìm ra chủng loại vi khuẩn mang khả năng chống lại bệnh thối củ do vi
kháng có trong đất ni trồng để tạo ra các chế phẩm sinh học nhằm phịng trừ bệnh thối củ hành tím do vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Các yêu cầu chung về năng lực của phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn., 2005.
[2] I. 5.-3. :. 2. .. TCVN 6663-3:2008, "Chất lượng nước lấy mẫu," in Phần 3: Hướng dẫn
bảo quản và xử lý mẫu.
[3] Chất lượng nước lấy mẫu- Phần 3 Hướng dẫn vào bảo quản xử lý mẫu, 2003.
[4] Chất lượng nước phát hiện đếm Escherichia coli và Coliforms: Phần1: PP lọc màng,