II. PHƯƠNG PHÁP API 20NE
3. Cách thực hiện phương pháp
3.1. Phân lập vi khuẩn
Đồng nhất kỹ nước nuôi thủy sản và đường tiêu hóa rồi pha lỗng đến các nồng độ 10- 3, 10-4 và 10-5, bơi 0,1 ml dịch pha lỗng lên đĩa thạch King A và ủ ở 30oC. Sau 24 giờ, quan sát chọn lọc những khuẩn lạc có màu xanh lam, màu của mơi trường chuyển sang xanh lục, tiến hành các thí nghiệm sàng lọc tiếp theo để sàng lọc ra các chủng thuần chủng. Các chủng này được nuôi trên môi trường thạch King B để quan sát huỳnh quang và môi trường lỏng King A để kiểm tra sự tiết pyocyanin.
3.2. Xác định các gen đặc trưng cho loài Pseudomonas aeruginosa
Các cặp mồi PA-F và PA-R: PA-F: 5'-GGGGATCTTCGGACCTCA-3 '; PA-R: 5'- TCCTTAGAGTGCCCACCCG-3' là cụ thể (Spilker và cộng sự, 2004) và có thể được sử dụng trong vi khuẩn nghiên cứu Đoạn gen PA 956 bp được khuếch đại trong dịng có độ đặc hiệu và độ nhạy 100% đối với Pseudomonas aeruginosa. Chu kỳ nhiệt của phản ứng bao gồm 94oC-5 phút; 35 chu kỳ (94oC-30s; 58oC-30s; 72oC-45s) và hoàn thành phản ứng ở 4oC. Kiểm tra sản phẩm PCR trong gel agarose 1,5%, đệm TAE 1X.
3.3. Định danh vi khuẩn (theo Kit 20NE cho vi khuẩn Gram)
Phương pháp được thực hiện được dựa trên hướng dẫn của nhà sản xuất API 20NE kit (BioMérieux, Pháp), và tóm tắt như sau: 18-24 giờ sau, lấy 2 khuẩn lạc từ đĩa nuôi cấy, thêm 4ml nước muối 0,9%, khử trùng; khuấy đều để tránh làm hỏng tiên và tiêm mao, không tạo bọt. Môi trường vi khuẩn này được thêm vào các phản ứng đã có trước bằng
cách dùng pipet. Các phản ứng vi hiếu khí GLU, ADH và URE yêu cầu bổ sung dầu khống và các phản ứng hiếu khí GLU, ARA, MNE, MAN, NAG, MAL, GNT, CAP, ADI , MLT, CIT và PAC thả chất lỏng vi khuẩn dưới đầu giếng (không đổ chất lỏng). Ủ mẫu trong khay đã làm ẩm ở 30oC trong 24 giờ và đọc kết quả.
3.4. Phương pháp tách chiếc xác định hàm lượng PYO (Essar, 1990)
Ly tâm dung dịch ni cấy vi khuẩn ở tốc độ 5000 vịng / phút trong 10 phút, thu lấy phần nổi phía trên, loại bỏ tế bào, thêm cloroform theo tỷ lệ thể tích 1: 2 (1 dung dịch: 2 cloroform), lắc đều, để yên trong 15 phút, lấy ra nổi phía trên, và thu lấy cloroform xanh lam có chứa PYO Floor. Sau đó thêm HCl 0,2M để axit hóa theo tỉ lệ thể tích 1: 1, lắc kỹ, dung dịch chuyển sang màu đỏ. Pha loãng phép đo OD ở bước sóng 520 nm để xác định nồng độ của hoạt chất. Hàm lượng PYO được xác định theo cơng thức sau: PYO (µg / ml) = OD520 x Độ pha loãng x 17,072.
4. Kết quả nghiên cứu:
4.1. Phân lập vi khuẩn và đặc điểm hình thái của PYO. Các chủng Pseudomonas
Theo khả năng của vi khuẩn sinh PYO tạo ra sắc tố xanh đặc trưng cho PYO trên môi trường King A, làm thay đổi màu của mơi trường (Hình 1-A), và phát huỳnh quang trên môi trường King B để tách và sàng lọc. PYO tiết ra dưới ánh sáng tử ngoại 360 nm (Hình 1B) và trong mơi trường King A lỏng. Từ các mẫu nước đã tách, thu được 11 chủng vi khuẩn có khả năng sinh PYO ở các mức độ khác nhau (Bảng 01). Danh sách các thực tập sinh PYO được biểu diễn rõ trong bảng dưới đây: PS1; PS2; PS3; PS4; PS5; PS6; PS11; PS33; PS35; PS39 và PS44.
Từ kết quả thu được, dựa trên việc xác định hàm lượng PYO tiết ra trong môi trường King A lỏng, chủng PS39 có khả năng sinh PYO cao nhất so với các chủng khác. Dựa trên kết quả này, chủng PS39 đã được chọn để nghiên cứu thêm.
Kết quả nhuộm Gram (Hình 1-C) và kính hiển vi điện tử qt (Hình 1-D) cho thấy chủng PS39 là trực khuẩn gram âm, hình que, trịn ở hai đầu, dài khoảng 1-1,5 μm, Khoảng 0,5-1 μm Chiều rộng, độc lập hoặc theo cặp.
4.2. Kết quả PCR các đoạn gen đặc trưng cho loàicủa Pseudomonas aeruginosa của Pseudomonas aeruginosa
Cặp mồi trên (PA-F; PA-R) 100% có độ đặc hiệu và độ nhạy với Pseudomonas
aeruginosa (Spilker và cộng sự, 2004), và được sử dụng để khuếch đại đoạn gen PA có
chiều dài 956 bp. Hình bên dưới là kết quả của sự điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen đặc hiệu loài Pseudomonas aeruginosa cho thấy các chủng phân lập theo đặc điểm hình thái và tiết PYO đều dương tính với một dải DNA đơn, kích thước khoảng 1000 bp.
4.3 .Đặc điểm sinh hoá của chủng phân lập
Sử dụng bộ Kit 20NE (Bionmerux của Pháp) để định danh các chủng vi khuẩn Gram(-). Chủng vi khuẩn phân lập quan tâm Pseudomonas PS39 được sử dụng và kết quả thu nhận so sánh với chủng chuẩn ATCC 27853 và trình bày theo bảng 2 dưới đây. Với chủng PS39, các phản ứng (-): sinh indole (TRP); Urease (URE), arabinose (ARA); mannose (MNE), penylacetic acid (PAC); ở các phản ứng (+): khử NO3 (NO3); chuyển hóa Arginine Dihydrolase (ADH); thủy phân esculin (ESC), gelatin
(GEL); chuyển hoá β-galatosidase (PNPG), glucose (GLU), mannitol (MAN), Nacetylglucosamine (NAG), potassium gluconate (GNT), capric acid (CAP), trisodium citrate (CIT).
Số liệu ở bảng 2 cho thấy đặc điểm sinh hoá của chủng Pseudomonas sp. PS39 phân lập giống với đặc điểm sinh hoá của chủng chuẩn Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 từ ATCC. Kết quả này thêm phần khẳng định các kết quả về đã nhận được của chủng Pseudomonas sp. PS39 trong các thí nghiệm trước.
4.4 Chiết xuất và định lượng thành phần hiệu quả pyocyanin
Đánh giá khả năng sinh PYO của Pseudomonas. PS39, chủng PS39 được nuôi trong môi trường King A ở 30oC và lắc ở 200 vịng / phút trong khoảng 5 ngày, nó tiết ra sắc tố PYO màu xanh lục (Hình 4-A), hịa tan trong nước và cloroform, khuếch tán ra ngồi và mơi trường chuyển sang màu xanh lục. Thực hiện chiết PYO theo phương pháp trên, như trong Hình 4-B. Dịch chiết thu được có màu xanh lam và trong suốt (Hình 4-C), và hàm lượng được xác định bằng phương pháp so màu 520 nm.
4.5. Khả năng kháng khuẩn của pyocyanin của chủng Pseudomonas sp. PS39
4.5.1. Khả năng chống vi sinh vật thử nghiệm
Để nghiên cứu phổ kháng khuẩn, người ta thu được dịch chiết PYO từ chủng
Pseudomonas. Như đã mô tả trong phần phương pháp, hoạt động ức chế của PS39
chống lại vi sinh vật thử nghiệm (VSVKD) đã được thử nghiệm.
Kết quả cho thấy giá trị MIC (1,625µg / ml) của PYO ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram (-) và nấm thấp hơn giá trị MIC (3,25) và 6,5µg / ml của vi khuẩn Gram (+). ). Giá trị MIC của kháng sinh cần thiết để ức chế vi khuẩn trong nghiên cứu này cao hơn nhiều so với PYO; ví dụ, để ức chế vi khuẩn Gram (+) EE faecalis ATCC299212, Streptomycin cần 79 lần nồng độ MIC của PYO và để ức chế Gram (-)