IV. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN PSEUDOMONAS SP CÓ KHẢ
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Phân lập Pseudomonas sp. từ đất trồng cây cà chua
Năm chủng vi khuẩn (ký hiệu P01, P02, P03, P04, P05) được phân lập từ mẫu đất rễ cà chua chiết xuất từ đất của gia đình ở Hịa Q, quận Ngũ Hành Sơn, thành phố Đà Nẵng có thể bắt màu huỳnh quang khi môi trường King's B tiếp xúc với tia cực tím (Hình 1). Các chủng vi khuẩn này đã được làm thuần và sử dụng để thử nghiệm thêm.
Đặc điểm hình thái của 5 chủng được trình bày trong Bảng 3.1.1.
Bảng 3.1.1. Đặc điểm khuẩn lạc của 5 chủng vi khuẩn phân lập
Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của 5 dịng phân lập, họ nhận thấy khuẩn lạc của chúng có hình trịn, lớn, nhẵn và phẳng, giống như trứng ốp la, với P01, P04 và P05 có tâm ởchính giữa. Một số dạng có chất nhờn, xốp, có mép răng cưa ở rìa, chẳng hạn như P02 và P03. Sắc tố làm cho khuẩn lạc có màu xanh lục rõ ràng bằng mắt thường, chẳng hạn như P04 và P05. Đường kính khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn thay đổi từ 0,3 mm đến 1,5 cm.
Theo đặc điểm hình thái chung của các chủng Pseudomonas sp., kết quả phân lập của các chủng nêu trên là tương tự nhau. Vì vậy, khả năng cao có thể xác định được 5 chủng vi khuẩn trên, thuộc chi Pseudomonas. Sau khi thuần 5 chủng vi khuẩn trên, thực hiện lần lượt khả năng đối kháng với Ralstonia solanacearum để phát hiện chủng nào có khả năng đối kháng tốt nhất với vi khuẩn héo xanh Ralstonia
Hình 3.1.2. Hình dạng khuẩn lạc của 5 chủng vi khuẩn P01, P02, P03, P04 và P05 3.2. Khả năng đối kháng của Pseudomonas sp. và Ralstonia solanacearum
Khả năng đối kháng của 5 chủng phân lập đối với Ralstonia solanacearum đã được đánh giá. Kết quả đối kháng được thể hiện trong hình 3.2.1 và bảng 3.2.2.
Hình 3.2.1 Hoạt lực đối kháng giữa 5 chủng vi khuẩn phân lập và Ralstonia
Bảng 3.2.2 Hoạt lực đối kháng của 5 chủng vi khuẩn phân lập và Ralstonia
solanacearum sau 72 giờ
Kết quả cho thấy có 2 chủng vi khuẩn có thể đối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum, xuất hiện vịng vơ khuẩn với phạm vi đường kính là 0,3 mm-1,5 cm.
Đặc biệt chủng P04 có khả năng gây đối kháng mạnh với R. solanacearum, đường kính đối kháng là 1,5-5 cm (Hình 3). Vì vi khuẩn dễ dàng phát triển, làm diện tích đối kháng lan rộng.
Hình 3.2.3 Hoạt lực đối kháng mạnh giữa chủng vi khuẩn P04 và Ralstonia
solanacearum sau a) 24 giờ, b) 36 giờ, c) 48 giờ và d) 72 giờ
Theo nghiên cứu của Lê Thị Thanh Thủy và Lê Như Kiều, đã phân lập Pseudomonas
aeruginosa có thể đối kháng Ralstonia solanacearum với đường kính đối kháng 1,2
cm (Lê Thị Thanh Thủy, Lê Như Kiều, 2010). So với chủng P04 được phân lập trong nghiên cứu này, P04 là R. solanacearum, mạnh hơn chủng Pseudomonas do hai tác
giả nghiên cứu, đường kính 1,5 - 5 cm sau 24-72h nuôi cấy.
3.3. Định danh các chủng vi khuẩn đã chọn:
Các đặc điểm hình thái và sinh hóa của chủng P04 đã được nghiên cứu, kết quả được trình bày trong Bảng 3.3.1.
Bảng 3. 3.1.Đặc tính của chủng Pseudomonas P04
Công nghệ sinh học phân tử đã được sử dụng để giải trình tự đoạn gen 16S-rRNA của chủng P04 và định danh loài của vi khuẩn. Kết quả mẫu đã được Công ty TNHH MYV Sinh Hố Phù Sa. Đọc kết quả theo trình tự Nuclêơtit của gen 16S-rRNA và phân loại BLAST của chủng P04 chỉ ra rằng chủng P04 có trình tự vùng gen 16S- rRNA (Hình 3.3.2) tương đồng lên đến 99,79% với lồi Pseudomonas aeruginosa (mã NR_117678.1, Hình 3.3.3). Điều này cho phép kết luận rằng chủng vi khuẩn P04 là Pseudomonas aeruginosa.
Hình 3.3.3. Kết quả so sánh sự tương đồng giữa chủng P04 và Pseudomonas aeruginosa DSM 50071
4. Kết luận:
Mẫu đất trồng củ cà chua của gia đình tại P.Hịa Q, Q.Ngũ Hành Sơn, TP.Đà Nẵng đã phân lập được 5 chủng vi khuẩn có ký hiệu P01, P02, P03, P04 và P05, chúng có thể phát triển tốt trong môi trường King's B và bắt màu huỳnh quang khi quan sát dưới tia cực tím. Trong đó, chủng P04 có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn
Ralstonia solanacearum. Chủng vi khuẩn P04 được định danh là Pseudomonas aeruginosa.
5. Kết quả nghiên cứu cơng trình :
Kết quả của nghiên cứu là cơ sở để đa dạng hóa các chế phẩm sinh học, cải thiện và ứng dụng chế phẩm Pseudomonas sp. vào lĩnh vực nơng nghiệp trong phịng và chữa bệnh héo xanh do vi khuẩn..
Bệnh héo xanh do vi khuẩn gây ra là bệnh rất khó phịng trừ, bệnh khơng chỉ xuất hiện trên cây cà chua mà còn xuất hiện trên các loại cây có giá trị kinh tế cao như khoai tây, ớt, vừng, lạc, đậu tương… Vấn đề phòng chống bệnh hiện nay vẫn cịn rất nhiều khó khăn và phức tạp. Tại nhiều hộ trồng cà chua, để hạn chế dịch bệnh lây lan, người dân thường thực hiện các biện pháp phịng trừ tồn diện, tích cực canh tác đất, chọn giống cây trồng ở vùng không nhiễm bệnh. Tuy nhiên, các phương pháp này khơng mang lại hiệu quả cao vì phụ thuộc nhiều vào điều kiện ngoại cảnh. Một trong những phương pháp chính được sử dụng để tiêu diệt bệnh héo xanh do vi khuẩn hiện nay là sử dụng thuốc trừ sâu hóa học. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc hóa học là cách chữa bệnh tạm thời cho cây và chỉ diệt được bệnh nhẹ, sau một thời gian bệnh sẽ tái phát và gây nhiễm trùng nặng hơn. Hơn nữa, nếu sử dụng nhiều loại thuốc hóa học với liều lượng lớn trong thời gian dài sẽ làm mất cân bằng quần thể vi sinh vật có ích trong đất, kìm
hãm sự phát triển của vi sinh vật có ích, ngồi ra cịn có thể tạo điều kiện cho vi sinh vật có hại, nấm bệnh hay cơn trùng phát triển. Mặt khác, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong sản phẩm và đất sẽ gây ô nhiễm nguồn nước ngầm và gây hại nghiêm trọng cho sức khỏe con người và động vật. Vì vậy, các phương pháp hóa học đang dần được thay thế bằng các phương pháp sinh học, và một trong những hướng cơ bản của phương pháp là tăng cường sản xuất các chế phẩm sinh học. Có nhiều chủng vi khuẩn đang được sử dụng làm chế phẩm (Phạm Văn Kim at el., 2010), trong đó có chủng
Pseudomonas sp. Chúng ln được quan tâm nghiên cứu hàng đầu vì sở hữu khả năng
tổng hợp một số chất ngoại bào, kích thích sự phát triển của rễ cây, tăng sức đề kháng, ức chế sự phát triển của nhiều vi sinh vật gây bệnh (Santos et al., 2007; Chu Nguyên Thanh, Đào Ngọc Diệp, 2018; Mansoor et al., 2007). Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên cũng đã góp phần đa dạng hóa chế phẩm sinh học, cải tiến và ứng dụng Pseudomonas
sp. vào trong lĩnh vực nơng nghiệp, nghiên cứu này nhằm mục đích chọn ra một dịng Pseudomonas sp. có khả năng chống lại vi khuẩn gây bệnh héo xanh Ralstonia solanacearum cho cây cà chua, và có thể được sử dụng để sản xuất các chế phẩm
phòng trị bệnh héo xanh do vi khuẩn R. solanacearum.
V. ĐỊNH DANH CHỦNG ĐỐI KHÁNG CỦA PSEUDOMONAS
AERUGINOSA TRONG HÀNH TÍM.
1. Tổng quan phương pháp:
1.1. Phương pháp phân lập, nuối cấy vi khuẩn
Việc phân lập vi khuẩnn là giai đoạn quan trọng trong q trình nghiên cứu ni cấy vi khuẩn.
Phương pháp phân lập mục đích chính là tách chủng vi khuẩn ra khỏi quần thể ban đầu tạo thành các bản sao thuần khiết để khảo sát và định danh. Sau khi nuôi cấy ở trong mơi trường các vi khuẩn phát triển hình thành các khuẩn lạc, dựa trên hình thái của các khuẩn lạc sẽ mang sự đặc trưng của từng loại vi khuẩn. Việc chọn lọc chính xác chủng khuẩn lạc phân lập là một phần quan trọng trong việc định danh vi khuẩn học.
Trong quá trình ni cấy vi khuẩn, việc quan trọng là tránh để các nguồn vi sinh vật lạ xâm nhập vào môi trường. [17] [18]
1.2. Phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA
Giải trình tự gen 16S rRNA như sau: - Trích xuất DNA bộ gen
- Khuếch đại PCR gen 16S rRNA
- Thu được trình tự nucleotide của gen rRNA 16S khuếch đại
- So sánh trình tự với trình tự nucleotide hiện có trong cơ sở dữ liệu
Do 16S rRNA rất cần thiết cho các hoạt động của vi khuẩn. Trình tự của 16S rRNA được sử dụng rộng rãi trong việc xác định định danh và phân loại các chủng vi khuẩn. Định danh chính xác các loại vi khuẩn dựa trên trình tự nucleotide đặc trưng của gen mã hóa cho 16S rRNA của vi khuẩn bằng kỹ thuật giải trình tự gen.
1.3. Phân tích phương sai - ANOVA trên phần mềm SPSS20
Phân tích phương sai (Analysis of Variance) được gọi là kiểm định ANOVA là một kỹ thuật thống kê tham số được sử dụng để so sánh các bộ dữ liệu. Phân tích ANOVA có chức năng đánh giá sự khác biệt tiềm năng trong một biến phụ thuộc mức quy mơ
bằng một biến mức danh nghĩa có từ 2 loại trở lên. Kỹ thuật kiểm định ANOVA này được phát triển bởi Ronald Fisher năm 1918.
2. Phương pháp phân lập và định danh các chủng vi sinh vật có thể chống lạibệnh thối củ hành tím do vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa: bệnh thối củ hành tím do vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa:
Đối tượng nghiên cứu:
- Các chủng vi khuẩn đối kháng trong đất có khả năng phịng trị bệnh thối củ hành tím do vi khuẩn P. aeruginosa .
- Chủng vi khuẩn P. aegurinosa được cung cấp bởi Nhóm Nghiên cứu Bệnh cây thuộc Phịng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
- Hành tím giống và hành tím địa phương được Chi cục Bảo vệ Thực vật tỉnh Sóc Trăng cung cấp.
3. Phương pháp phân lập các vi khuẩn trong đất trong hành tím:
Thu thập các mẫu đất ở ruộng trồng củ hành tím khơng bị nhiễm bệnh ở vùng hoặc mẫu đất bị nhiễm bệnh ít. Ở mỗi ruộng trồng, ta sẽ thu mẫu đất ở 9 điểm có độ sâu từ 0 - 20 cm theo đường chéo góc và trộn đều và bỏ vào túi nhựa. Sử dụng 10g mẫu đất và 90 mL nước cất vô trùng và lắc đều trong 30 phút trên máy lắc ngang. Sau đó pha lỗng dung dịch 1000 lần với nước cất vơ trùng và trải đều 50 µL lên mơi trường trường nutrient agar (NA) [5 g peptone, 3 g beef extract, 5 g NaCl, 20 g agar, thêm nước cất vừa đủ 1.000 mL, pH 6,8]. Sau khi nuôi cấy 48 giờ, chọn lọc các khuẩn lạc vi khuẩn có hình thái khác nhau nằm trên bề mặt mơi trường nuitrient agar mới cho đến khi ròng. Các chủng vi khuẩn này được bảo quản trọng dung dịch glycerol 15% để sử dụng cho việc ngiên cứu sau.
3.1. Khảo sát mức độ đối kháng của vi khuẩn phân lập trong đất đối với
Pseudomonas aeruginosa trên đĩa thạch
Trải đều 50 µL huyền phù vi khuẩn P.aeruginosa (đươc nuôi cấy 48 giờ, với mật số 109 CFU/mL) lên đĩa môi trường NA. Tiếp theo chấm sinh khối khuẩn lạc vi khuẩn phân lập (được nuôi cấy 48 giờ trên đĩa thạch NA) lên đĩa NA mới tại 3 điểm cách đều nhau, và ủ ở nhiệt độ 28±2oC ở trong tủ ủ 48 giờ. Việc này được lặp lại 3 lần trên 3 đĩa khác nhau cho mỗi chủng vi khuẩn phân lập khác nhau. Sau khi ủ, lựa chọn các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng và đo bán kính vịng vơ khuẩn. Bảo quản các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng để nghiên cúu các thí nghiệm sau
3.2. Khảo sát khả năng ức chế được vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa của dịch nuôi cấy vi khuẩn đối kháng
Sử dụng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa được nuôi cấy đặt trên đĩa mơi trường và tạo 4 giếng (đường kính 6 mm) cách đều và đối xứng bằng ống đục vô trùng. Đánh số các giếng theo chiều kim đồng hồ từ 1 - 4. Các chủng vi khuẩn đối kháng nuôi cấy trong 10 mL môi trường nutrient broth (NB). Ở các thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày sau khi nuôi cấy, đem 1 mL vi khuẩn dạng huyền phù và ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 15 phút để được dịch ni cấy khơng cịn các tế bào vi; lấy 20 µL dịch ni cấy
cho vào giếng 1 và 3; sau đó lấy 20 µL mơi trường NB cho vào giếng 4 và ở giếng 2 cho 20 µL nước cất thanh trùng và ủ ở nhiệt độ 28±2oC trong tủ ủ 48 giờ. Mỗi loại chủng vi khuẩn lặp lại 3 lần trên 3 đĩa khác nhau. Quan sát khả năng tạo vịng vơ khuẩn của dịch ni cấy và đo bán kính vịng vơ khuẩn.
3.3. Khảo sát khả năng chống lại bệnh thối củ hành tím của vi khuẩn đối khángtrong nhà lưới trong nhà lưới
Thí nghiệm được thực hiện theo hồn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại gồm 3 nhân tố (1) chủng vi khuẩn đối kháng được tuyển chọn nuôi cấy ở trên phần 1.1 và 1.2, (2) mật số vi khuẩn đối kháng (109, 108 và 107 CFU/mL) và (3) phương pháp xử lý vi khuẩn đối kháng. Nghiệm thức đối chứng âm được xử lý với nước cất thanh trùng và nghiệm thức đối chứng dương được xử lý với thuốc hóa học Starner 20WP 1%.
Đất phù sa trồng hành tím được phơi khơ, băm nhỏ, xử lý phèn bằng vôi bột. Tiếp theo , trộn tỉ lệ 3:1:2 đất: trấu: cát theo khối lượng, Sử dụng chậu nhựa (25x17cm) cho hỗn hợp đất và tưới nước làm mềm đất. Củ hành tím giống tách 1 lớp vỏ bên ngoài và dùng ethanol 70%, ủ với trấu ẩm cho ra rễ trước khi đem trồng vào chậu (10 củ/chậu).
Củ hành tím được gieo bệnh bằng cách tạo vết thương khoảng 5mm xung quanh cổ củ và tiêm 500 µL huyền phù vi khuẩn P. aegurinosa (mật số109 CFU/mL) trong thời điểm 30 ngày sau khi gieo trồng. Tiến hành ghi nhận phần trăm mức độ nhiễm bệnh (tỉ lệ thể tích củ nhiễm bệnh/tổng thể tích củ của mỗi củ hành) trong 4, 8 và 12 ngày sau chủng bệnh. [19]
4. Định danh vi khuẩn đối kháng:
Vi khuẩn đối kháng được định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA kết hợp với Hệ thống phân loại vi khuẩn Bergey’s. [20]
5. Xử lý số liệu:
Các số liệu thu thập được phân tích phương sai ANOVA bằng phần mềm SPSS 20, sự khác biệt giữa các nghiệm thức được so sánh bằng kiểm định Duncan ở độ tin cậy 95%.
6. Kết quả:
6.1. Khả năng đối kháng của huyền phù và dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn phânlập từ đất lập từ đất
Hiện có tổng số 133 chủng được phân lập từ bốn mẫu đất trồng hành tím. Loại chủng vi khuẩn có hình dạng khuẩn lạc phổ biến là trịn, rìa có khía hoặc khơng khía, màu trắng trong hoặc trắng đục, kích thước khơng đồng đều. Trong các chủng vi khuẩn được phân lập, 4 chủng vi khuẩn (2C, 3A, 3B và 4A) sở hữu khả năng đối kháng cao với vi khuẩn P. aeruginosa. Chủng 3B có khả năng đối kháng cao nhất (bán kính vịng vơ khuẩn = 6 mm). Ở thí nghiệm khảo sát về khả năng ức chế mầm bệnh thối củ bằng dịch tế bào dịch ni cấy của hai chủng 2C và 4A có khả năng ức chế vi khuẩn P. aeruginosa với bán kính vịng vơ khuẩn lần lượt là 5,6 mm và 6,0 mm tại thời điểm sau 48 giờ nuôi cấy. Nhưng, khả năng ức chế mầm bệnh của dịch nuôi cấy sẽ biến mất đi
sau 4 ngày nuôi cấy. Dựa vào kết quả kiểm nghiệm, có hai chủng vi khuẩn 3B và 4A đạt điều kiện để khảo sát khả năng làm giảm bệnh thối củ trong điều kiện nhà lưới. [21]
6.2. Hiệu quả giảm bệnh của các chủng vi khuẩn đối kháng trong điều kiện nhàlưới lưới
Kết quả khảo sát hiệu quả giảm bệnh thối củ hành tím do vi khuẩn P. aegurinosa của
hai chủng vi khuẩn 4A và 3B trong điều kiện nhà lưới được trình bày ở Bảng 1. Trong đó, áo củ với chủng vi khuẩn 3B đạt hiệu quả giảm bệnh cao nhất ở mật số 108 CFU/mL. Trong tất cả các kiểm nghiệm chủng vi khuẩn bằng phương pháp áo củ, hiệu quả giảm bệnh kéo dài đến thời điểm 12 NSCB chỉ riêng nghiệm thức áo củ với chủng vi khuẩn 4A ở mật số 107 CFU/mL thì cho hiệu quả giảm bệnh tại thời điểm 8 NSCB. Còn đối với phương pháp chủng vi khuẩn đối kháng vào đất, kết quả nghiệm thức với