4.2.2.Hoá mô miễn dịch và biểu hiện của Ki-67 Hoá mô miễn dịch Hoá mô miễn dịch
Chẩn đoán bệnh qua phân tích DNA, RNA và các protein từ bệnh phẩm là một trong những bước tiến của ngành giải phẫu bệnh phẫu thuật (surgical pathology). Dù phân tích mô học theo kỹ thuật nhuộm hematoxylin và eosin (H & E) trên lát cắt mô tiêu chuẩn vẫn được xem là trung tâm của chẩn đoán [115], [122]. Nhưng ngày nay, kết quả này dần được thay thế bởi những kỹ thuật cải tiến hơn ở mức phân tử và miễn dịch [84], [127], [145].
Ứng dụng hoá mô miễn dịch trong chẩn đoán có nhiều ưu điểm có ý nghĩa. Đầu tiên, kỹ thuật này dựa trên những lát cắt bệnh phẩm và thao tác trên kính hiển vi thông thường [115], [145]. Thứ hai, hệ thống chẩn đoán này khá nhạy, có thể phát hiện dấu ấn kháng thể ở nồng độ thấp, nếu chọn kháng thể đúng, phức hợp kháng nguyên-kháng thể rất chuyên biệt. Cuối cùng, theo Richard C.K. và CS (2002) [127], kỹ thuật này khá kinh tế chỉ cần không gian vừa đủ, không cần kỹ thuật cao. Trong xu thế đó, chúng tôi phân tích biểu hiện của Ki-67 trong quá trình đọc GPB trong nghiên cứu này.
Biểu hiện của Ki-67
Kháng thể Ki-67 được mô tả đầu tiên bởi Gerdes vào năm 1983 [133] và được sử dụng như chất chỉ điểm cho sự tăng trưởng tế bào (proliferating cells), đồng thời dùng rộng rãi trong hai thập niên gần đây [31], [56], [112]. Nghiên cứu này có 39 mẫu mô bệnh được nhuộm hoá mô miễn dịch. Biểu đồ 3.9 cho thấy biểu hiện của Ki-67 có chỉ số trung bình phần trăm khá thấp 12,9±8,4%. Các tế bào u lớp ngoài của mẫu mô (outer layer cells) dễ dương
tính với chất nhuộm hơn lớp trong. Điều này do hoạt động tăng trưởng vùng này cao hơn vị trí khác [31], [62], [115].
Kết quả nghiên cứu trên nhiều nhóm đối tượng khác nhau cho thấy chỉ số Labelling Index của Ki-67 sau khi nhuộm hoá mô miễn dịch là khá thấp [13], [30], [122], [132], [159]. Điều này cũng phù hợp với kết quả của chúng tôi (biểu đồ 3.9). Mức biểu hiện của Ki-67 cho biết độ hoạt động của tế bào, hay độ ác tính của tổn thương [17], [30], [76], [78]. Do đó, có thể kết luận rằng u NBM xương hàm có sự hoạt động của tế bào trong tổn thương khá thấp và giúp khẳng định bản chất lành tính của bệnh [56], [60].
Ngoài ra, kháng nguyên Ki-67 biểu hiện hoàn chỉnh khi: (1) Hiện diện liên tục trong suốt chu trình hoạt động của tế bào; (2) Mất nhanh chóng khi có hiện tượng tế bào chuyển sang giai đoạn không tăng trưởng trong chu trình hoạt động [132]. Điều quan trọng khi bộc lộ tế bào u qua Ki-67 là nhuộm bệnh phẩm trên lame đúng kỹ thuật, nồng độ thuốc hợp lý, đánh giá phản ứng qua tế bào dương tính rõ. Kết quả thường liên quan đến cấu trúc tế bào (nhân, màng nhân, tế bào chất) [31], [119]. Vì thế cần kiểm tra loại bỏ những kháng thể không chuyên biệt có thể xuất hiện và gây nhiễu [127].
Liên quan giữa đặc điểm lâm sàng, X quang và Ki-67
Đặc điểm lâm sàng là những dấu hiệu quan trọng, thể hiện sự hoạt động của tổn thương nói chung, tế bào u nói riêng. Bên cạnh đó, bệnh càng ác tính tế bào u tăng trưởng (proliferating cells) và mức Ki-67 càng cao [30], [31], [160]. U NBM xương hàm dù lành tính, nhưng có khả năng tái phát, hiện diện nhiều tế bào tăng trưởng cao [13], [17], [65], [129]. Khảo sát mối liên quan giữa hoá mô miễn dịch và đặc điểm lâm sàng là cần thiết khi chẩn đoán bệnh. Bologna và CS (2008) [122] đã khảo sát hoá mô miễn dịch của 120 u NBM xương hàm tại Mexico, đánh giá mối liên quan giữa lâm sàng và mức độ biểu hiện của Ki-67. Kết quả cho thấy đặc tính biểu hiện bên ngoài của u không liên quan đến chỉ số biểu hiện Ki-67 (Labelling index). Kết luận này
cũng phù hợp với bảng 3.20 và 3.21 đồng thời với nhiều báo cáo đã được công bố trên y văn [131], [132], [133]. Điều này có thể do bệnh là lành tính, tế bào ít hoạt động hay tăng trưởng [76], [115], phát triển trong thời gian dài, biểu hiện ra bên ngoài chậm [88], [101] nên ít có mối liên quan giữa yếu tố lâm sàng và Ki-67 trong quá trình phân tích mẫu bệnh phẩm.
Phim X quang là phương tiện cận lâm sàng không thể thiếu trong quá trình chẩn đoán u NBM xương hàm. Kết quả X quang còn có thể cho biết mức độ xấm lấn của bệnh [52], [96], [147]. Tuy nhiên, bản chất, mức độ tăng trưởng tế bào cần phải có những dấu ấn của các chất chỉ điểm thông qua nhuộm hoá mô miễn dịch [25], [115]. Mối liên quan giữa chỉ số biểu hiện Ki- 67 trong mẫu mô bệnh và đặc điểm X quang giúp chẩn đoán hay tiên lượng mức hoạt động tế bào dựa trên phim X quang.
Tác giả Yi Li và CS (2012) [159] đã thực hiện khảo sát 178 u NBM xương hàm, đánh giá mối liên quan này. Kết quả cho thấy nhóm bệnh có dạng thấu quang bờ rõ kèm tăng xơ xung quanh, thấu quang không kèm tăng xơ, và bờ không rõ có Ki-67 tương ứng là 2,06±0,82; 3,17±1,23; 4,25±1,01(%). Dù giá trị trên khác nhau nhưng do chỉ số khá thấp nên mối liên quan này không quan trọng. Kết quả nghiên cứu này (bảng 3.22) cũng khá phù hợp với kết luận trên và các khảo sát được công bố [13], [31], [56], [60], [143]. Điều này góp phần khẳng định mức độ tăng trưởng của bệnh không thể dự đoán chỉ qua đặc điểm thể hiện trên phim X quang.
Liên quan giữa đặc điểm đại thể, vi thể và Ki-67
Đặc điểm đại thể là một trong những yếu tố quyết định trong quá trình chẩn đoán ban đầu bản chất bệnh [41], [112]. Ngoài ra, nó cũng đóng vai trò quan trọng khi tiên lượng điều trị, đồng thời có liên quan đến chỉ số biểu hiện của Ki-67 khi nhuộm hoá mô miễn dịch hay mức độ hoạt động tế bào [109], [115], [143]. Kết quả nghiên cứu (bảng 3.18) cho thấy độ hoạt động tế bào của u dạng hỗn hợp cao nhất, thấp nhất là dạng giống nang. Bên cạnh đó, bảng 3.14 cho thấy đặc điểm đại thể liên quan chặt chẽ với phương pháp đã
can thiệp trước điều trị của BN. Như vậy có thể đặt giả thuyết rằng những can thiệp đó làm gia tăng độ tăng trưởng hay ác tính của tế bào u. Tuy nhiên, điều này cần được kiểm chứng qua những nghiên cứu trên quần thể mẫu lớn hơn.
Đặc điểm vi thể hay mô học của bệnh là cơ sở có giá trị cuối cùng để chẩn đoán xác định. Tuy nhiên, đánh giá mối liên quan giữa mức tăng trưởng tế bào và các dạng mô bệnh học là quan trọng trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh. Nghiên cứu của chúng tôi (bảng 3.18) thấy dạng u đặc/nhiều buồng dương tính với Ki-67 hơn các loại khác. Kết quả này phù hợp với nhiều khảo sát đã công bố trên y văn (bảng 4.5). Điều này cũng cho thấy tế bào u trong thể u nhiều buồng có khả năng tăng trưởng hay ác tính hơn các thể bệnh khác.
Bảng 4.5. Chỉ số Ki-67 và thể GPB trên y văn và nghiên cứu này
Tác giả (năm báo cáo)
Chỉ số của Ki-67 trên các thể giải phẫu bệnh (*) Nhiều buồng Một buồng Thể dây chằng xơ Nơi khảo sát Bologna (2008) [122] 12,8 15,1 --- Mexico F. Sandra (2001)[137] 5,08 4,42 2,8 Nhật Gadbail (2012) [60] 25,1 21,6 --- Ấn Độ Ronell (2013) [132] 14,9 15,2 --- Mexico Nafarzadeh (2013) [166] 7,2 6,1 --- Iran Nghiên cứu này 15,0 9,9 6 Việt Nam
Ghi chú: (*): Tính theo trung bình % của Ki-67 (Labelling index).
Bên cạnh đó, các nghiên cứu về bệnh học lâm sàng đã chứng minh rằng u men thể nhiều buồng có tính xâm lấn nhiều hơn so với thể một buồng [91], [92]. Điều này được giải thích do u thể một buồng có ít tế bào hình lưới–sao (stellate reticulum-like cells) hơn so với thể nhiều buồng. Hầu hết thành phần này có liên quan đến lớp đáy hay biểu mô lớp ngoài, nơi dễ dương tính với Ki-67. Nói cách khác, các tế bào đảo cực và sự khác nhau về cơ chế tăng trưởng của các thể bệnh làm thay đổi chỉ số của Ki-67 [122], [132], [133].
Tác giả (năm báo cáo) Chỉ số Ki-67 theo các dạng vi thể (*) Follicu Plexi Basal Acan Gran Des
F. Sandra (2001)[137] 5,05 3,7 6,8 3,6 --- 2,75 Ronell (2013) [132] 18,6 16,1 8,7 8,1 --- 1,9 Rogelio (2014) [131] 6,7 --- --- 4,1 2,3 --- Ayman H (2013) [25] 6,11 19,7 --- 3,33 --- --- Bologna (2008) [122] 20,7 15,2 --- 9,8 --- --- Nghiên cứu này 14,2 16,3 11 8,6 12,5 7,2
Ghi chú: (*): Tính theo tỉ lệ % trung bình biểu hiện (Labelling Index) của Ki-67. Follicu: dạng ống nang. Plexi: dạng đám rối. Basal: dạng tế bào đáy. Acan: dạng gai. Gran: dạng hạt. Des: dạng dây chằng xơ.
Chỉ số Labelling index của chất chỉ điểm Ki-67 biểu thị độ xâm lấn cũng như tăng trưởng của tế bào ác tính [46], [76]. Do đó, những kết luận trên y văn (bảng 4.6) và kết quả bảng 3.19 đã góp phần khẳng u NBM dạng ống nang hay đám rối có độ hoạt động của tế bào hay ác tính cao hơn so với dạng khác. Từ đó thầy thuốc cần lập kế hoạch can thiệp triệt để hơn đồng thời tiên lượng dè dặt hơn. Tuy nhiên, u thuộc bệnh hiếm trong số các tổn thương vùng hàm mặt, số lượng nghiên cứu về bệnh được công bố vẫn còn hạn chế [30], [122]. Nên kết quả này cho thấy khuynh hướng biểu hiện của tổn thương, và cần được khẳng định thêm nữa qua các khảo sát khác với mẫu lớn hơn.
Liên quan giữa kết quả điều trị và Ki-67
Các nghiên cứu về lâm sàng u NBM xương hàm cho thấy khó có thể tiên lượng được bệnh vì có khá ít đánh giá mức độ hoạt động sinh học của tế bào u. Đồng thời chưa có một bằng chứng rõ nào cho thấy hình ảnh tế bào học của u (như dạng nang hay đám rối) có thể xác định được mức độ xâm lấn của bệnh ở từng trường hợp cụ thể hay có thể cho phép tiên lượng khả năng tái phát của bệnh [119]. Chỉ có yếu tố sinh học được sử dụng để tiên lượng bệnh lý này là u NBM dạng nang thì ít xâm lấn hơn, đặc biệt đối với trường hợp có răng ngầm bên trong [159].
Hoạt động tăng trưởng của tế bào u, qua biểu hiện của Ki-67 khi nhuộm hoá mô miễn dịch, cho phép lượng giá được khả năng xâm lấn của bệnh, hữu ích cho tiên lượng bệnh [17], [60], [131]. Nghiên cứu 32 BN u NBM xương hàm, tác giả Ayman H, et al (2013) [25] thấy chỉ số LI của Ki-67 trong 8 trường hợp tái phát là 15,6±7,1 (%), trong khi ở trường hợp không tái phát là 4,0±1,9 (%). Kết quả này tương ứng với dữ liệu của chúng tôi, có 1 trường hợp tái phát với chỉ số này là 19% (chỉ số LI trung bình của mẫu là 12,9%), kết quả GPB sau lần mổ 2 là ung thư nguyên bào men xương hàm. Với chỉ có một BN tái phát, nhưng chúng tôi cũng tán đồng với tác giả Yi Li (2012) [159] cho rằng chỉ số LI của Ki-67 càng cao thì u càng dễ tái phát.
Mức độ tăng trưởng của tế bào là chìa khoá của đánh giá mức độ xâm lấn của tế bào u NBM đồng thời ảnh hưởng đến kết quả điều trị đã được đề cập trên y văn [30], [78], [122], [132]. Tuy nhiên, kết quả của chúng tôi (bảng 3.31, 3.32, 3.38, 3.39) thấy mối liên quan giữa chỉ số LI của Ki-67 và kết quả điều trị trong 6 hay 12 tháng khá thấp, hay nói cách khác là Ki-67 không liên quan đến kết quả điều trị. Điều này có thể được giải thích bởi tỉ lệ biểu hiện của Ki-67 trong mẫu nhuộm u NBM nhìn chung thấp [65], [131], [133] nên mối liên quan ở đây không mang ý nghĩa. Mặc khác, để đánh giá kết quả điều trị u, thầy thuốc cần theo dõi BN thường từ 5 năm đến 10 hay thậm chí 20 năm [27], [40], [53], [75], [90], [136]. Do đó, quan sát này của chúng tôi có thể được xem là nền tảng bước đầu tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiến hành trong thời gian dài, liên tục, với số bệnh nhân lớn hơn.