IV. GIỚI THIỆU SHIGELLA
3. Phương pháp hiện đạ i:
3.1.Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kary Mullis đã phát minh ra kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase) vào năm1985, tạo nên một cuộc cách mạng lớn trong đời sống khoa học. Chỉ sau 8 năm (1993),K. Mullis đã được trao giải Nobel về hoá học nhờ phát minh này.
Nguyên tắc: Bộ công cụ dùng trong xét nghiệm “bộ Kít PCR” với độ nhạy rất cao với các vi khuẩn, cứ trong 25g mẫu thực phẩm có một con vi khuẩn cần tìm thì PCR sẽ phát hiện ra chúng. Điều đặc biệt là các bộ kít không chỉ gọi tên một loại vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm
màchúng có thể phát hiện ra 12 loại vi khuẩn khác nhau như:E.coli, E. coli0157:h7, Salmonella spp, Shigella spp, nấm mốc...
Tùy thuộc vào loại thực phẩm và số loại chỉ tiêu vi khuẩn gây bệnh cần kiểm soát đối với mỗi loại thực phẩm, các quy trình và bộ Kit PCR cho phép xét nghiệm và gọi tên tất cả các vi khuẩn nêu trên trong vòng 24 giờ (trừ Clostridium botulinum, cần thời gian nuôi cấy tăng sinh dài). Chúng được thiết kế cho 50 phản ứng PCR với 50 ống phản ứng,chứa đầy đủ thành phần dung dịch đệm PCR, mồi, nước... để giúp kiểm tra chính xác mức độ nhiễm vi sinh vật trầm trọng hay không.
Kỹ thuật PCR dùng phát hiện shigella được tiến hành trên cặp mồi SHIG khuếch đại cho trình tự 320bp trên plasmid xâm nhiễm đặc hiệu cho shigella và cặp mồi 16S khuếch đại cho trình tự có kích thước 1007bp nằm trong vùng bảo tồn cùa 16SrRNA hiện diện trong mọi loài vi khuẩn
Kết quả điện di của 13 chủng Shigellasonnei
So với phương pháp nuôi cấy truyền thống, phương pháp này cho hiệu quả chính x á c và hay hơn ở chỗ, nó phát hiện nhiều vi khuẩn gây bệnh hơn và tốn rất ít thời gian. Riêng đối với Shigella thì cho phép phát hiện shigella ở mức 10CFU/25g mẫu sau12→14h tăng sinh,cho kết quả sau 24h.
3.2.Kỹ thuật LA (latex agglutination)
Nguyên tắc: Ngoài ra dựa trên kỹ thuật phân tích kháng thể dùng trong phát hiện
Shigella còncó bộ Kit Wellcolex,bộ kít Bactigen dựa trên kiểu phân tích LA. Được sử dụng từ những năm 1956,xét nghiệm LA rất phổ biến tại các phòng thínghiệm lâm sang,áp dụng để phát hiện hơn 100 bệnh truyền nhiễm Thử nghiệm này dựa trên sự ngưng kết giữa các hạt cao su với các kháng thể huyết thanh.Chẩn đoán xác định Shigella từ các mẫu lâm sàng trong 24h với độ đặc hiệu (>98%) và độ nhạy (100%), hơn nữa thao tác rất
đơn giản và dễ sử dụng.
Ví dụ : Cơ chế của thử nghiệm LA:
Các mẫu thực phẩm cần kiểm tra sau khi được xử lý được pha trộn với hạt cao su đã được phủ một kháng thể hoặc kháng nguyên cụ thể. Nếu mẫu bị nghi ngờ có sự hiện diện của shigella, các hạt cao su sẽ cụm lại với nhau (tựu lại).
So với phương pháp nuôi cấy truyền thống, phương pháp này cho hiệu quả chính x á c và hay hơn ở chỗ, nó phát hiện nhiều vi khuẩn gây bệnh hơn và tốn rất ít thờigian. Riêng đối với Shigella thì cho phép phát hiện shigella ở mức 10CFU/25g mẫu sau12→14h tăng sinh,cho kết quả sau 24h.
Sơ đồ của 1 hạt latex: Vòng tròn màu đen đại diện polystyrene với sulfat và các gốc tự doVòng tròn màu trắng biểu thị nhóm acid sulfonic của bề mặt. Đuôi đại diện hydrocarbon liên kết các phần của hạt
Sau thử nghiệm
Nếu thử nghiệm là âm tính, cao su vẫn còn mịn và giữ lại màu sắc ban đầu của nó. Nếu thử nghiệm dương tính, hạt cao su thay đổi màu sắc khác biệt so với hạt cao su xung quanh.
Chú ý :
Cần lưu ý Shigella là nhóm chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm, có thể gây cáctriệu chứng bệnh với liều lượng rất thấp 10 tế bào/ g sản phẩm.Do vậy cần tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Shigella cần làm đối chứng (+) cũng như khi thao tác trên các chủng phân lập lại.Các môi trường hay mẫu vật sau nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa