III. Staphylococcus aureus 1 Đặc điểm:
a) .Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaetion)
• PCR là phương pháp dùng enzyme khuếch đại chọn lọc một đoạn DNA theo luật số mũ. Phản ứng được thực hiện với enzyme DNA chịu nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Mỗi chu kỳ phản ứng gồm 3 chu kỳ:
o Biến tính DNA có tác dụng tách 2 sợi đơn từ sợi khuôn khép, nhiệt độ biến tính khoảng 950C trong 30-60 giây.
o Bắt cặp hai mồi và hai sợi đơn của khuôn, nhiệt độ khoảng 40-700C, kéo dài 30-60 giây.
o Bước tổng hợp, kéo dài chuỗi nhiệt độ 720C giúp cho enzyme DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt nhất.
• Ưu điểm của phương pháp này là: o Thời gian cho kết quả nhanh.
o Có thể phát hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy. o Ít tốn kém về mặt nhân sự.
o Hóa chất dễ tìm kiếm và tồn trữ. • Khuyết điểm:
o Tất cả các tế bào chết và tế bào sống đều cho kết quả dương tính trong kỷ thuật PCR.
o Mật độ vi sinh vật hiện diện trong mẫu thường thấp, nên cần phải có thêm bước nuôi cấy để có mật độ đủ để phát hiện bằng PCR.
• Ứng dụng:
o Dòng hóa các gene hay một đoạn gene, đoạn RNA. o Tạo đột biến.
o Định lượng những khác biệt trong thể gene RT-PCR. o Điều tra hình sự.
o Kiểm tra chất lượng, sự lẫn tạp sinh học.
Một vài nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện gene độc lực của S.aureus.
• Ở Akineden, 2001 đã dùng kỹ thuật PCR khuếch đại phát hiện gene độc lực của S.aureus trong sữa bò có độc tố ruột A (SEA), SEC, SED, SEG, SEI, SẸ, TSST-1 nhưng không thấy SEB, SEE, SHE và có cả sự hiện diện của hai độc tố màng ngoài là ETA và ETB.
• Abdulmula E1-Ghodban, 2005 đã khảo xác 63 dòng S.aureus (40 từ nguồn bệnh sốc độc tố và 23 nguồn từ thức ăn) tìm độc tố TSST-1 bằng PCR. Chỉ có 3 dòng được phát hiện có sự hiện diện của TSST-1.
• L.Chapaval, 2006 khảo xác 132 dòng vi khuẩn được phân lập từ sữa nguyên kem có sự hiện diện của độc tố ruột và TSST-1.
a.1 Phương pháp PCR xác định coaguase của S.aureus trong sữa.• Vật liệu: • Vật liệu:
o 628 mẫu sữa được lấy từ các trang trại nuôi bò ở Murrah. Vi khuẩn kiểm tra: lấy 10 µl sữa từ mỗi mẫu rồi cấy ria 5% đĩa thạch máu cừu và cấy trên đĩa thạch lactose của Mac Conkey sau đó ủ trong 24 giờ ở 370C.
o Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc : Gram dương, catalase dương tính, oxidase âm tính → xác định là Staphylococcus. ssp. Tụ cầu phân lập được tiếp tục phân loại coalugase (+) và (-) bằng thử nghiệm Citrate trên môi trường huyết tương thỏ (Gibbs và Skinner, 1966). Lấy mẫu coalugase (+) tiếp tục xác định đặc điểm sinh hóa theo thử nghiệm enzyme chịu nhiệt (Faruki và Mumbai, 1986). Sau đó kiểm tra bằng ngưng kết Latex (Staph Latex Test Kit, Himedia , Mumbai) và lên men Mannitol.
o DNA lấy trực tiếp từ sữa bằng phương pháp Phuektes (2001). Lấy 1,5 ml sữa li tâm với 600 ml đệm NTE. Vorter mẫu và ổn định dịch bằng 100 µl (24% sodium dodecyl sulphate) và giữ trong bể nước (800C, trong 10 phút ). Sau đó cho thêm 12µl protein asek (20mg/ml, Fermentas, USA) và ủ tiếp trong bể nước (560C, 2h).
• Hút 100µl NaCl 5M và 80µl CTAB-NaCl cho thêm vào ủ (560C, 10 phút ). Sau đó cho thêm PCI (phenol chloroform isoamyl alcohol) và CI (chloroform isoamyl alcohol) cho đến khi mẫu được làm sạch.
• Thu nhận kết quả ở 1/10 thể tích sodium acetate 3M (pH=5.2) và thêm 2 thể tích ethanol 100% lạnh vào, giữ ở -200C để kết tủa DNA. Sau đó li tâm 15000 vòng/15´ ở 40C để tách ethanol và thu DNA, sau đó rửa DNA 2 lần bằng ethanol 70%, cuối cùng làm khô.
• tách DNA từ vi khuẩn nuôi cấy.
o DNA được tách ra từ những vi khuẩn đã được phân lập trước đó. Những dòng khuẩn lạc riêng rẻ được để qua đêm trong 25µl dung dịch đệm TE và đun sôi đến 990C trong 15 phút sau đó làm lạnh nhanh bằng cách đặt trên băng.
o Các mẫu kết quả DNA thu được, được bảo quản ở -200C và 5µl của mỗi mẫu được sử dụng để phân tích PCR.
• Phản ứng PCR thực hiện với MgCl2 , Tap DNA polymerase, mồi. Cặp mồi: F: ACCACAAGGTACTGAATCAACG