III. Staphylococcus aureus 1 Đặc điểm:
c. Phương pháp
c.3 Định lượng S.aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc:
Cấy khuẩn lạc vào môi trường BHI, ủ 370C/ 24
giờ. 2ml Mẫu
Cấy vào ống nghiệm môi trường MBS.
Trộn đều
ủ 370C/ 24 giờ
Tìm khuẩn lạc đặc trưng: tròn, lồi, có tâm đen, trong
suốt, 1-1,5mm, có vòng sang chung quanh khuẩn
lạc
MT: MBS
Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3 ml huyết tương, ủ 370C/ 24 giờ.
Đọc kết quả,
Có S.aureus thì có xuất hiện khối đông
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh MSB, mỗi
nồng độ 3 ống lập lại, ủ 37oC, 48giở
Chọn ống (+)đục ở mỗi độ pha loãng
Ria lên đĩa thạch BPA, ủ 37oC, 48 giở
Chọn khuẩn lạc đặc trưng
Cấy vào TSA. ủ 37±1oC, 24 giờ
Thử nghiệm ngưng kết coagulase
Ghi nhận số coagulase (+)ở mỗi độ pha loãng
Tra bảng MPN
Mật độ S.areus (MPN/g hay MPN/ml)
Trã lên đĩa thạch BPA, ủ 37oC, 24-48 giờ: trãi trên thạch máu, ủ 37oC,24 giờ
Đếm khuẩn lạc đặc trưng
Lấy 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào TSa, ủ
37oC, 24 giờ
Lấy 5 khuẩn lạc không đặc tưng cấy vào TSA, ủ 37oC,24
giờ
Thử nghiệm ngưng kết coagulase
Tỷ lệ khuẩn lạc đặc trưng coagulase (+)
Tỷ lệ khuẩn lạc kh ông đặc trưng
coagulase (+)
M ật đ ộ S.areus (CFU/g hay CFU/ml) đếm khuẩn lạc không đặc trưng Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy ống nồng độ thập
phân 10-1, 10-2, 10-3
Bước 1: đồng nhất mẫu.
đồng nhất bằng máy dập mẫu 30s. Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa thạch Baird Parker sẽ xuất hiện khoảng 10 – 100 khuẩn lạc / đĩa.
Hình 3.3 sơ đồ pha loãng mẫu.
Bước 2: phân lập trên môi trường chọn lọc:
• Cấy 0,1 ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird Parker. • Dùng que cấy tam giác thủy tinh ( thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bề mặt môi
trường cho đến khi khô. Thực hiện lập lại 3 đĩa môi trường thạch Baird Parker cho mỗi loại pha loãng. Thực hiện tương tự với môi trường thạch máu. Lật ngược đĩa, ủ ở 37 ± 10C trong 24 – 48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đối với môi trường thạch máu.
• Sau 24 giờ, khuẩn lạc S. aureus trên môi trường thạch Baird Parker có đường kính 0,5 – 1 mm, lồi , đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng 1 – 2mm bao quanh.
Hình 3.4 khuẩn lạc mọc trên MT Baird Parker và MT thạch máu
• Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục ủ 48 giờ. Sau 48 giờ khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm, có màu đen bóng, Mẫu ban đầu
lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc một số dòng S. Aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần đến và đánh dấu cả hai loại khuẩn lạc.
• Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S.aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục, lồi, có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1 – 2µm. Hầu hết S. Aureus có vùng tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này.
Bước 3: khẳng định
• Dùng que cấy vòng cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ môi trường Baird Parker lên môi trường thạch TSA, ủ ở 37 ± 10C trong 24 giờ.
• Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống nghiệm chứa huyết tương đã rã đông, ủ ở 37 ± 10C. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2,4,6,8 và 24 giờ. Tính tỉ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng. Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu. Kết quả thử nghiệm là (+) khi có khối đông huyết tương hình thành (mọi mức độ đông kết đều được xem là (+)). Kết quả là (-) khi không có hình thành khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy.
Bước 4 Tính kết quả:
• Mật độ S.Aureus trong mẫu được tính như sau :
Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = 10.(NtHt + NaHa)/( F1+F2) o Trong đó:
o F: là độ pha loãng
o Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng
o Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng
o Ht: tỷ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với khuẩn lạc đặc trưng
o Ha: tỷ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc không đặc trưng.