III. Staphylococcus aureus 1 Đặc điểm:
b) Lai phân tử:
• Phương pháp lai phân tử còn gọi là phương pháp mẫu dò, probes. Phương pháp này dùng để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm dựa trên sự phát hiện một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật. Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là quá trình
lai phân tử. Quá trình này bao gồm sự tách rời của hai mạch đôi của chuổi xoắn kép DNA và sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA có nóng chảy tm của phân tử DNA và sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA có trình tự nucleortide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường. Một trong hai mạch DNA bổ sung được cố định trên một giá thể rắn. Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với trình tự DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt.
• Mục đích sử dụng gene trak S.aureus là một phương pháp dùng để phát hiện
S.aureus trong thực phẩm. Thử nghiệm DNA hybridization sử dụng đầu dò DNA S.aureus và thiết bị đo màu để phát hiện S.aureus trong thực phẩm sau khi đã làm giàu mẫu. Phương pháp này dùng để định lượng xác định sự hiện diện của S.aureus ở mức độ ô nhiễm > 3 tế bào/g trong mẫu thực phẩm gốc. Một mẫu được xem là không có sự hiện diện của S.aureus nếu giá trị hấp thụ thu được ít hơn hoặc bằng giá trị giới hạn mà thử nghiệm đã thành lập. Một mẫu được xem là có sự hiện diện của S.aureus nếu giá trị hấp thụ thu được lớn hơn giá trị giới hạn mà thử nghiệm đã thiết lập.
• Thao tác thực hiện:
o Làm phong phú các mẫu thực phẩm.
o Lấy 0,5 ml mẫu cho vào 12x0,75 ống nghiệm.
o Cho 0,1 ml thuốc thử để xử lý sơ bộ mỗi ống và lắc trong 5 giây, sau đó ủ trong bồn nước 370C trong 30 phút.
o Cho thêm 0,1 ml thuốc thử phân giải vào mỗi ống nghiệm và lắc trong 5 giây. Thay nước và ủ trong bồn nước 370C trong 45 phút.
o Thêm 0,5 ml mẫu dò S.aureus vào mỗi ống nghiệm.
o Đặt dipstick vào mẫu, nâng lên, hạ xuống 5 lần để trộn và ủ ở 650C trong 1 giờ.
o Rửa dipsticks hai lần mỗi lần 1 phút, lần đầu 650C, sau đó ở nhiệt độ phòng.
o Chuyển tiếp vào ống chứa 0,75 ml enzyme liên kết và ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút.
o Chuyển dipsticks đến ống chứa 0,75ml chất nền tạo màu và ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút.
o Lấy dipsticks ra và thêm 0,25ml thuốc dừng.
o Đọc kết quả bằng cách sử dụng Gene Trak quang kế. Đo ở bước sóng 450 nm, mẫu âm tính thì OD < = 0,1, mẫu dương tính OD > 0,1. Để có kết quả chính xác nhất thì có thể thử nghiệm lại các phản ứng sinh hóa.
• Thuốc thử phân giải là: NaOH 0,75M.
• Hóa chất rửa: 50mM Tris-HCl (pH=7,5); 2mM EDTA; 100mM NaCl.
• Chất nền tọa màu: Tetramethylbenzidine, bảo quản ở nhiệt độ 2-80 C.
• Enzyme liên kết: Antifluorescein antibody, bảo quản ở nhiệt độ 2-80 C.
• Mẫu dò phát hiện chứa fluorescein isothiocyanate.
• Thuốc dừng: sulfuric acid 2M.
• Độ nhạy 1-5gCFU/25g.
• Thời gian thử 3h (sau khi làm giàu 24h).
• Các xét nghiệm cho mỗi kit lên đến 98.
• Hệ thống dò gene trak (Framingham, USA): mẫu dò là những đoạn oligomer DNA đánh dấu bằng hóa chất phát quang.