Chọn đệm chiết mẫu thích hơp

Dung dịch chiết rút có ảnh hưởng đến thành phàn và số lượng các c h At trong dịch chiết. Khi đã chọn được điều kiện nuôi cấy tối ưu (lổ thu dượt' nhiều sinh khối thì đ ệ m chiết m ẫu cũng phải là đ ệm có khả năng chiết rút hiệu quả nhất tức là enzim giới hạn thu được không bị mất hoạt lính.

Rất nhiều nghiên cứu trước đây đã dề cập đến ảnh hưởng của pH và nồng độ NaCl đến hoạt độ phân giải của enzim trong đệm phản ứng. Nghiên cứu này là m ộ t kh ía cạ nh nh ỏ trong nghiên cứu cơ bản nhằm chọn lựa dạm chiết t ế bào cồ p H và nồng độ muối thích hợp dồng thời m ở lộng khả nìíng ứĩig dụ ng củ a en zim đang nghi ên cứu.

+ Ảnh hưởng của p H đệm đến hàm lượng protein tách chiết

T ế bào vi kh uẩ n được chiết trong đệm TB ở các pH 5.5; pH 6,5; pH 7 ()• pH 7 4- pH 8,0 ( 5 0 m M NaCl). Sau đó tiến hành phản ứng và điện di. Kếl

q u ả n g h i ê n c ứ u đ ư ợ c t r ì n h b à y ở b ả n g 2 v à h ì n h 3 .

5,5 1,524 2,205 6.6 6,5 1,630 2,358 7,1 7,0 1,600 2,323 7,0 7,4 1,570 2,270 6,9 8,0 2,094 2,659 12,0 H ì n h 3 : P h ổ ( l i ê n

(li

pH mỏi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzim vì T1<> ảnh luring đến mức độ ion hoá cơ chất, enzim và ảnh hưởng tiến độ bền của proicin e n7,im [1 Ị. pH đ ệ m chiết tế bào của hầu hết những nghiên cứu nư ớc day ở khoaiig pi I liun g tính. Điện di đồ (hình 3) cho lliấy: ở lííl cả các (lẹm nghiên

cứu c ó p! I k hác nhau hoạt tính d ị c h c h i ê ì b iểu hiện nh ư nhau, c h ứ n g tò l Atig

hoại độ của enzi m giới hạn đang nghiên cứu thích hợp ở khoảng pH (lịch chiết lương đối rộng Nghiên cứu của chúng tôi cung phù hợp với nghiên n í u Irổn cnzim giới hạn S m 30 DI được tách \iĩ S cleiu w io na s nm iiiu m iiim i II4Ị. H àm lượng protein dược chiết ra từ đệm pH 5,5; pH 6.5; pH 7.0: |iH 7.4 (lao

(Vỏng k h ổ n g đ á n g kể. Đ ệ m T B c ó pH 8 , 0 h àm l ượng protein là lơn

gằn gàp doi so với các liệm khác, tuy nhiên hoại (lọ cùa c n / i m giới hạn kliong thaV dổi cho lliấy, có thể hà m lượng các protein khác kh ổng Anil iurơng đốn hoại độ R E đang nghiên cứu. pH thích hợp cho hoạt dộng của

n h i ê u e n z i m v a o k h o ả n g 7 Ị 1]. Mặt k há c, c á c bước SÁC kí d ể tinh s ạc h C!i7im

+ Ảnh hưởng của nồng độ N aCl trong đệm đến lượng protein tách chiết

Đ ệ m TB ở các nồ ng độ muối NaCl 2 5 m M ; 50 mM; lOOmM; 200mM; 3 0 0 m M trong pH 7,4 và các thành phần khác của đệm không đổi. T ế bào vi khuẩn được chiết trong các đ ệ m này, tiến hàn h phản ứng và điên di. Kết quà nghiên cứu được trình bày ở bảng 3, hình 4.

B ả n g 3: Ản h hưởng nồng độ muối NaCl trong điệm đến lượng protein tách chiết Nồng độ NaCỈ (M) O D 280 O D 26n ^Protein (mg/ml) 0,025 0,919 1,424 6,8 0,05 1,197 1,913 7,6 0,1 1,0J 1 1,559 7,5 0,2 1,197 1,964 6,9 0,3 0,862 1,308 6,6 H ì n h 4 : P h ổ d i ệ n

di

Nhiều ngh iên cứu đề cập đến ảnh hưởng của nống độ muối đến hoại

dọ

enzim Co nh ữn g enzim bị ức c h ế mạn h ở nồng độ muối lớn hơn 2 5 m M NaCl [161. Ng ước Ìậi EcoRĨ thề hiện hoạt tính m ạn h nhất ở nồng độ 0.2 M NaCI. Nếu ở nong cíộ đ ệ m 0, l M NaCl, E c oR Ỉ chỉ còn 25% hoạt độ [38J. 'I heo bảng

có Ihể do ở nồng độ N a + quá cao ức c h ế hoạt động của loại enzim này. Theo BioLabs, enzi m H a e III bị ức c h ế m ạ n h ở nồn g độ muối lớn hơn 25 niM NaCl. Th e o Cantor và Schimmel, 1980 [8] ở nồng đ ộ NaC! cao khả năng lioà tan của protein enzim tăng do tương tác giữa những phân tử protein giảm di. Ngược lại, ở nồ n g độ muố i Ihấp enzim giới hạn của vi khuẩn 5 hoạt dộng

m ạn h.

Vì dịch chiết thô cần phải q ua các bước tinh sạch đòi hỏi trong tiệm cần phải có mộl lượng muối xác định ít nhất là 0 ,0 5M dể tăng khá năng liCn kếl trong kỹ thuật sắc ký [6, 7], Do vậy, chúng tôi thấy rằng lioạt lính eiư im giới hạn thể hiện tốt nhất ở đ ệ m T B pH 7,4; 0 , 0 5 M NaCl. Chúng lòi lựa chọn (lộm này clio những thí ngh iệ m tiếp theo.