I, Nghiên cứu sử dụng lizozim phá màng tế bào vi khuíỉn để tách cliiêt enzim giới hạn
2. Th ãm dò phương pháp tinh sạch enzim giới hạn
N h ữ n g phát hiện đầu tiên về enzim giới hạn đã m ở la hướng diều tra cũng n h ư nghiên cứu sâu hơn loại enzim này. Chúng tôi tiến hành tinh sạch enzim với phương pháp sắc ký lọc geỉ, sắc ký trao đổi ion và ái lực. Các bước tinh sạch enzi m giới hạn được tiến hành theo sơ đồ sau:
- Phá vỡ tế bào bằng siêu Am - Ly tâin
Dịch enziin thô
Sắc kỹ trao dổi ion
Sephacryl S-200 D E A E - Xenluloza Heparin s e p h a i m a
CL-6B Sắc ký
Irao đổi ion
Sắc ký ái lực
I- Xenluloza Heparin sepharoza
CL-6B
Sơ đ ồ các bước tinh sạch enzim giới hạn cluìng vi khuẩn 5 - S ắ c ký lọc gel q u a cột S e p h a cry l S-200
Kếl q u ả thu được 3 đỉnh protein tirơng ứng với các pliíìn (loạn 5,14,19 được gọi ]à đỉnh 1, đỉnh 2 và đỉnh 3. C hún g tôi thừ hoạt tính ử 3 (lỉnh 111II dược với A D N X. Sau khi điện di trên gel agaroza 0,8%, kết quá phản ứng dược thể liiện ở hình 4
nằm giữa hai đỉnh prolein trên. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục thực hiên phan ứng của các phân đoạn 4, 6, 8, 10, 12 15, 17 cắt ADN X nhằm phát hiên các phan đoạn chiết rút qua cột Sephacryl có hoạt tính enzim giới Itạti (hình 5).
H ì n h 5: Phổ diện di của A D N X I I t'll g( agaroza dưới tác dụng của enzim giới
hạn các pliíln đoạn sau khi C| i ia cột Sephacryl S-200 / - Phản ứng ở p h â n (ỈOỢI! 4; 2 - Pỉìảiĩ ứnẹ ở p h à n (loan 6; 3 - P h ả n ỉĩĩỉg ở ph â n (loạn S; 4 - P hản ứìỉg ở p h á n (ÍOỌÌ1 Kì; 5 - P h ả n ứng (Ỷphân (locrn 12; 6 - Phản ứng ở p h â n (ĩoợn ì 5 7 - Phản ínig ỏ p h ân (ỉnạn / 7 .
N h ư vậy ở phan đoạn 4 (trước đỉnh 1) ADN X kh ồng bị cắt vì* hiểu
hiện thành I vệt sáng trên cột gel 1. Ở các phân đoạn 6, 8, 10, 12 (giữa (lỉnh
lvfi 2) sản pliấm phân cắt A D N Ằ, thể hiện rất rõ. ơ phân đoạn 15, 17 (sau
(tỉnh 2) tương ứng với CỘI gel 6 và 7 vẫn c ó những vạch giới lụm nhưng mờ Ỉ1ƠI1, xen vào (tó là những vạch inờ hơn nữa. Hoại tính enzim gi('<i hạn giam (lòi) và 111,11 ở những phân đoạn sau. Q ua kết quả thu dược sau klii sắc ký qu;t cột lọc gci Scphacryl S-200 cliúĩig tôi nhận thấy đỉnh lioạl tính xuống CÒ I kh;í nhanh, có I lie rằng protein eiizim này có trọng lượng phAn tử hill? Qu;i CỎI lọc gcl, e n / i m gió'i hạn <Jã pỉiÀn nào dược lách khỏi CÍÍC nuclcaza klioug dfk’ liiỌu NliíUH Ihílm (lò sAu hơn quy trình này, chúng lôi tiếp lục tinh sạch phô phíỉm bíing hai aìcli: Một pliòn qua cột sắc ký ái lực Heparin Scpliiiuva và inộl pliíìn CỊ11ÍI CỘI (rao dổi ion DIZAE - Xenluloza.
1 2 3 4 5 6 7
Dịch có hoạt tính sau khi q ua cột Sephacryl S-200 được tiếp tục tinh sạch bằng phương p h á p sắc ký ái lực với cột Heparin sepharoza CL-6B. Kết q uả thu được m ộ t đỉn h protein duy nhất (hình 6). Sau đó dùn g gradient nồng
độ NaCl từ 0 , 0 5 M - IM để dẩy sau khi đã rửa sạch hết tạp chất (C)P2RO=0).
C h ú n g tôi thực hiện ph ản ứng của các phân đoạn bám trên CỘI với
ADN X. Kết quả biểu hiện ở hình 7
3 5 7 9 11 13 15 17 19
Phân đoạn
Rùa--- ►4--- Đẩy--- ►
H ìn h 6* Sắc ký qu a cột Heparin Sepharoza LC-6B của dịch sau khi qua cột S e p h a c ry l s - 2 0 0 .
/ - Phản ứng ở phâ n (ỉoạiì 9; 3 - Phởn ứng (ỷ p hân (ỈOỢ1Ĩ I I ; 5 - P h ản ứng ở phâ n cíoạtì / 5 ;
Kếl CỊIIÍI cho thấy, ở pliAn đo ạn 9,10,11 có hoại tính cúa eii7Ìni giới lụm dược dẩy la ơ nồn g độ NaCI 0,1 5 M - 0,2M, phân đoạn 13. Ị 5, 17 <líĩ c;it ADNẰ lạo lliànli vệl sáng dưới đèn tử ngoại. Chúng lôi cho rằng, s;m khi <|ii;i cột Heparin .Scpluiroza CL - 6ĨÌ, enzim giới hạn đã được linh sạch kliĩí tiliiòu. '[’uy nhiên, đổ so sánh sản phẩm tinh sạch sau khi qua CỘI llepai in Scplumvỉi CL-613 với s;’m phẩm tinh sạch sau khi qua cột D E A E - Xenlulo7íi tứ dịch t ó hoạt lính tù CỘI Sephacryl s -200, chú ng tôi tiếp tục tin h sạch sán pliắm qua CỘI l )l ì / \ R - Xcululoza.
- S ắ c k ý í r a o d ố i i o n q u a c ộ t Ỉ ) E A E - X e n l u ĩ o ỵ a
15 u 11 dịch qua CỘI Sepliacryỉ s - 20 0 được cho lên cọt DEAF
xcn ln lo za có kích llurớc 1 .Ocni x8 ,0 cm dã được CÍÌ11 bíHig với dệin 'I lĩ -SÍÌII khi qua CỘI vScpiiacryl s - 200
2.502 00 2 00 oo 1.50 o 1.00 0.50 0.00
I Hull 8: Sắc ký q u a cột D E A E - xenluloza của dịch enzim s;ui kill qua CỘ1 S e p h a c ry l S -2 0 0
k í n h Ịhước cột: 1 x 8 c m ; T ố c <ỉộ chảy: J5ml/ii; Đ ệm ỉ lì p l ỉ 7/1; The lích mồi p h â n do ạ u 2 ml. Đ ẩ y bằnạ N a C I với các nồng (lộ 0,1 M, 0 ,2 M, 0,3M, 0.1M,
0 ,5 M , 0,6M .
Kél qua thu được 6 đỉnh protein trong (ló đỉnh pmlciii (ỉimv (liiy xuống CỘI ở nồng (lộ 0, 2 M có hoạt tính mạnh (hình 8. 9). Đỉnh protein Ilur I bị (líiy
à Dỏng độ NaCI 0,1 M có hàm lượng protein lớn nil At (hình 9. cọt pel 2. 3) có lioi.1t lí n h c n / i m g iớ i h ạ n n h u n g y ế u hơ n. N h ư v ậ y ĩíít c ó th ể c ó k lỉA n n n p lo n lạ i 2 lo ạ i is o s c h iz o m e r tr o n g c h ủ n g v i k lu iẩ n n à y . c ũ n g c ó tlìể (fin e c n / i m n ín
h ám trên CỘI với lực ion y ế u liên đã bị d ẩ y m ộ i phàn n g a y ờ n ò n g (lộ m uôi
( U M . Các I>11 An đoạn dính 49. 60, 68, 74 bị c1ẩy ở các nồng (tộ muối lưcíiií’ lỉng 0 3M. 0 4 M 0,5M , 0 ,6 M (lều thể hiện 1 VỘI sáng liên íirl diện (li (In
AI ) N/ \ íln bị c á c nwcleaza k h ôn g tlặc hiệu Cíil.
trên gel agaroza dưới lác (lunp của enzim các ptiAn (loạn qua cộ! D E A E - X e n l u k v a 1 - Pììàìì ứng ở phàn (ỈOỌIÌ 13; 3 - Phản ứng ở p ìiù n (ỈOỌII 32; 5 - Phản ứng ởpỉìâìì (ỉoạn 39; 7 - Phản ứng (ỉ ph à n (loạn 49; 9 - Plìảtì ứng ờ p h ò n (loạn 6S; 10- PÌIỞ11 ứng ở pììâiì (íoọn 74;
C h ún g tôi nhận thấy rằng hoạt tính enzim của chủng vi kluiíỉn 3 kliií
mạnh trong dịch chiết thô (ở độ pha loãng cao vãn còn hoạt lính). T h e n Iihièu
líìc giả, chỉ hằng 1 bước linh sạch c ó thể till! đưực c h ế pliẩm 01171111 giới h;m
tlurơng mại [7,10, 18, 22J. Theo tác giả Poch M.T., Sotnkuli G./\ ( IW5). mội ioschizomer của ỉ h i c \ \ \ là Sagỉ tách từ chủ ng Streptococcus (Ignhn tioc đíi
(lưực tinlì sạch chỉ qua 1 cột sắc ký. e nz im giới hạn nhạn (tirợr c ó hoạt tính
lAt cao, hoại (lộng của micleaza khống đặc hiệu hoàn loàn l'i loại hn [ 2 Ị. N h ằ m tìm hiểu khả năng t i n h sạch enziin giới hạn lừ vi kliuẢii 5, cluing Ini liến hành sắc ký dịch chiết thô qua cột Heparin Sepliaroza CL-f'R YỈI DRAI Xenlu loz a với những điều kiện sắc ký như đã trình bày trên