- Qua hai bước tinh sạch: bướ c1 dịch chiết thô được qua cột lọc gcl
Hình 27: Khuấn lạc nòi xạ khuẩn N018 nuỏi cấy trên mỏi trường Isp
Sau khi nuôi cấy, khuẩn lạc được chuyến vào mỏi trường dịch thế LB. thu sinh khối tế bào để điểu tra sự có mặt của enzim giới hạn có trong nòi xạ khuẩn này.
2.5.2 Điều tra sự có mặt của enzim giới hạn
Ly tâm dịch thè LB nuôi cấy thu tế bào . Hoà các tế bào trong đệ m pha loãng A theo tỷ lệ lg tế bào : 5ml đệm. Siêu âm phá tế bào 5 đến 6 m A trong * 3 phút ở 0 - 4°c đế tránh làm mất hoạt tính enzim. Dịch tố bào được ly tăm
15000 vòng /phút trong 30 phút ớ 0"c. Loại bỏ kết tua. thu lấy dịch trong đế điểu tra sự có mặt cùa enzim giới hạn.
A D N X được sử dụn g để phát hiện hoạt tính cắt của enzim giới hạn. 5 ^1 dịch chiết thô (dịch ly tâm ở trên ) được pha loãng ở các nồng độ khác nhau trong đệm phản ứng được ú với A D N X ở 37°c trong 2 giờ. Hỏn hợp sau phản ứng được điện di trên gel agaroza 0,5%. Kết quả thu được hình 28
1 2 3 4 5 6
Hình 28: Phổ điện di ADN trẽn gel agaroza dưới tác dụng của dịch chiết
enzim từ x ạ k h u ẩ n N 018 1- A D N Ả ch iú in 2- A D N Ã cắt bói Sac // 3- A D N Ầ + dịch chiết p h a loãng 7/9 4- A O N Ả + dịch chiết p h a loãng 1/27 5- A O N Ả + dịch chiết p h a loãng ỉ 181
liC11 các cột gcl mặc dù lưựng AL)N Ằ làm phán ứng là 1)1)11 nhan. () coi ecỉ }
dịch chiết pha loãng 1/9 nên hàm lượng nucleaza trong clịcli chiết có thê còn nhiồu khiến ADN hị cắt nhỏ (nát). Vì vậy khi chạy diện đi không nhìn Ilìíìv hăng ADN trên CỘI gcl mà chỉ là một vệt sáng dưới u v . ơ CỘI gel lliứ ị true với nồng độ pha loãng 1/27, do ham lượng các nucleaza kliône (lặc hiệu bị giám dáng kê liên xuất hiện băng ADN nhưng không duơc sác net. Kill pha loãne (lịch chiết lới 1/8] thì kct quả cho llìAy hoại lính cn/ini giới lụm CIIM chung xạ kluián N„ 18 thể hiện tốt nliál (cột gel thử 5), vạch ADN tiKỉni! ỨMí! với vạch ADN Ả cát bằng Sac II cluiẩn. Riêng dôi với CỘI gel llur 6 (1(1 non 12 (lộ pha loãng quá lốn 1/243 nôn hàm lượng enzim không dáng kẽ. Vì vạy hoại tínli cùa e n / i m cắt ADN }. không dược thể rõ ràng. Do ctó, ci v im liídi (lược lừ nòi xạ klìiiẩn N0 18 có hoạt tínli tương lự như Sí/C II (1(1I1Ú CÍH AI)N ).
ịỊÍõim Iiliu' Site !l I tie là cắl A D N Ằ lại những doạn nucleolil có t rì nil tự:
5'...CCCi( GG....V .V...GGCGCC...5’
Q u a dó ch ú ng lôi ihấy rằng hoạt tính enzim giới hạn Ilic hiện lui nliiìl tại uổng độ dịch cliièl pha ioãniĩ 1/81
2.6 ENZYM GIỚI HẠN TỪ CHỦNG XẠ KHUAN n o. 20
2.6.1 Nuòi cấy tê bào
Chủng xạ khu ẩn N 020 do trung tâm vi sinh học ứng dụng cung cấp. Chủng xạ kh uẩn được tiến hành nuôi cấy trên đĩa thạch trong môi trường Isp 4 để thu k hu ẩn lạc.