Siic ký trao đổi ion trên cột DEAE Xenluloza

Một phần của tài liệu ách chiết, tinh sạch và nghiên cứu tính chất một vài Endonucleaza giới hạn từ các nguồn vi sinh vật của Việt Nam (Trang 88)

D ịc li c h iế t rút th ô đ ư ợ c trực tiếp tinh sạ c h b ằ n g phương pháp qua CỘI

Irao đổi ion. T h ử ngh iêm sơ bộ được tiến hành trên cột DEA E Xenluloza với phương pháp đẩy phần h ấp phụ bằng gradient nồng dọ NaCI từ 0,05 M- 0,6M pha trong đ ệ m TB. Kết quả (hình 12) thu đưực 3 đỉnh prolcin (ương (1ỏ'i

sát nhau liong đó có I dỉnli protein thứ 2 có hoại tính tlirợc clỉiy ra khoảng

nồng độ 0,1 5 m - Q,2M. Sau đó, bước tinh sạch chính tliức được thực liiộn bằng cách đẩy phẩn hấp phụ bằng đệ m TB có NaCI với các nồng đò 0. IM; 0,2M; (),3M; 0,4M; (),5M; (),6M. Kết quả thu được 6 đỉnh protein (hình n . 14). Hoạt lính thể hiện rõ ở đỉnh protein 2 đẩy ở nồng độ muối 0.2M NíiCI. () dính protein I có sự gắn cạnh tranh giữa R E và nucleaza không (lặc liiỌu v;'i enzitn giới hạn ở đỉnh protein 1 và 2 có thể cùng là isoschizomer cùa ỉ h ì c III cùng cỏ li ong chủ ng vi khuẩn 5. Trong điều kiện phòng thí ngliiỌm, cluing tôi chỉ dừng lại ở bước thăm dò phương pháp linh sạch, clura có khả nfmjLi (li sâu nghiên cứu cấu trúc để có thể khẳng định kết quả một cácli chíic chim hơn.

IMi â n ( l o a n w

^ ___R ừ n _ --- ► « ---n f y--- ►

llitili 12: Sắc ký qua cột DBAE - xcnluloza cùa dịch cliict rliô. Đẩy gradient nồng ctộ 0 , 0 5 M 0.6M NaC’1.

4--- Rửa — --- Đẩy ---;--- ►

H ì n h 13: s ắ c ký qua cột D E A E - xenluloza củ dịch ctiiếl Iho. Đẩy lừng bước: 0,1M, 0,2M, 0,3M, 0,4M, 0.5M, 0 , 6 M

H ì n h 14: Phổ diện di của ADN

liên gel aaam /a dưới lác dụng

e n z i m các pliAn cloạn qiui CỘI

D E A E - Xenliiloza. /. Phân (loạn 24; 2. Phán (loạn 3 ì : 3. Phân (loạn 32; 4. Phân íĩoạti 33; 5. Phán (ỉoạn 43; 6. Phàn (loạn 51: 7. Phân (ỈOỌIÌ rì /.

ì Điện (li protein trên gel polyacrilamit có SI)S (SI)S - PA(ỈE>

Để (lánh giá mức (tộ tinh sạcli của clìế plnim e n / i m , ( bung lôi liến hành diện ell (lịch cliicl thô’ cùng các c h ế pluim e n / i m sau khi (|.ụ cạc bir.v sac ky lien gel p o ly a c r y la m it có SDS. Kết quả điện di (hình 15) Ilifly (01 Heparin sc pha roz a CL-6B có khả năng linh sạch e n / i m giới hạn vi kliuíỉn 5

có trọng lượng phân tử n ằ m trong kho ản g này? N h ư vậy, chế pliíun €1171111 dược tinh sạch m ộ t phẩn sau khi sắc k ý qua cột Heparin Sepharoza CL-6B và D Ẽ AE - Xeinluloza.

Kết q u ả của quá trình tinh sạch qua 2 cột sắc ký được thể hiện trên cót gel 5,6,7 (hình 15). Sau khi qua cột Sephacryl S-200, protein e n / i m được linh sạch sơ bộ nhưng dã loại bỏ được khá nhiều loại protein gắn cạnh tranh trốn cột Heparin Sepharoza CL-6B và D E A E - Xenluloza (cột gel 5). Cụ thể. s;’m

p h đ n i s ắ c k ý q u a c ộ t H e p a r i n S e p h a r o z a , đ ã q u a m ộ i h ư ớ c l i n h Si l t' ll CỊUÍ1 <-■<'(

Sephacryl S-200, cho một băng protein khá sắc nét chứng lỏ rằng ch cn7.ini

giới hạn vi khuẩn 5 tương đối linh sạch (cột gel 6). Băng protein liny nằm trong vùng có M W từ 66. 00 0 Da - 97.400 Da. C h ế phẩm enzim Síiu kl)i qua cột D E A E - X en lu lo za có 2 băng protein (cột gel 7), chứng lỏ rằng c hế pliẩm này có dộ tinh sạch k é m hơn so với c h ế ph ẩm qua CỘI heparin (cột gcl 6). Từ kết quả điện di trên gel polyacrylamit có SDS, chúng tòi cho lằng:

Nếu chỉ qua một bước linh sạch bằng sắc ký qua cột Hcp;irin Sepliaroza CL-6B hoặc D E A E - Xenluloza thì c h ế phẩm ch eii7.ini giới hĩMi

(lưực linh sạ ch m ột phẩn.

Q ua hai bước linh sạch: bước 1 dịch chiết thô được qua m l lọc gcl Sepliacryl S-200 và bước 2 d ịc h có hoạt tính (bước I) qua CỘI H eparin Sepluiroza CL -6B hoặc D E A E - Xenluloza, ch ế pliẩm cli er vi m giới hạn

t ư ơ n g đ ố i t i n h s ạ c h . K h ả n ă n g g ắ n d ặ c h i ệ u p r o t e i n e n z i n i v i klitKÌii 5 n e n CÓI

Heparin Sepharoza CL-6B tốt hơn so với cột D E A E Xenluloza.

2 3 4 5 6 7 H ì n h 15: Phổ điện (li proicin CHÍ1

clmng vi khuẩn 5 <|ua c;íc bước tinh s;u’h 21.5 kl ) a I U kDa 10 kl ),1 r-i / - Pi (’trill clìHÔn; 3 - C h í’ p h ẩ m RF. I Ị I K I ( òt Hcptiriì) S ep h a ro za CL-6IÌ:

4 - Cỉu~’ pìiám RE (ỊIKI < Ộ1 / ’/• \1‘ Xenluloza; 5 - C h ế p h ẩ m R E r/ihi c ộ t S r p ỉ h i n v/ S-200; 6 - C ỉ i ế p ỉ u i m R F Ì i v p t ì i i ĩ ì S c p h a t n-<t CL-6ỊÌ ị hước 2); 7 - C h i’ phôìii RF. < Ị H( I cột />/■ \f'. Xenlulo-d (Ỉn(ớc2). 15

Một phần của tài liệu ách chiết, tinh sạch và nghiên cứu tính chất một vài Endonucleaza giới hạn từ các nguồn vi sinh vật của Việt Nam (Trang 88)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(139 trang)