D ịc li c h iế t rút th ô đ ư ợ c trực tiếp tinh sạ c h b ằ n g phương pháp qua CỘI
Irao đổi ion. T h ử ngh iêm sơ bộ được tiến hành trên cột DEA E Xenluloza với phương pháp đẩy phần h ấp phụ bằng gradient nồng dọ NaCI từ 0,05 M- 0,6M pha trong đ ệ m TB. Kết quả (hình 12) thu đưực 3 đỉnh prolcin (ương (1ỏ'i
sát nhau liong đó có I dỉnli protein thứ 2 có hoại tính tlirợc clỉiy ra khoảng
nồng độ 0,1 5 m - Q,2M. Sau đó, bước tinh sạch chính tliức được thực liiộn bằng cách đẩy phẩn hấp phụ bằng đệ m TB có NaCI với các nồng đò 0. IM; 0,2M; (),3M; 0,4M; (),5M; (),6M. Kết quả thu được 6 đỉnh protein (hình n . 14). Hoạt lính thể hiện rõ ở đỉnh protein 2 đẩy ở nồng độ muối 0.2M NíiCI. () dính protein I có sự gắn cạnh tranh giữa R E và nucleaza không (lặc liiỌu v;'i enzitn giới hạn ở đỉnh protein 1 và 2 có thể cùng là isoschizomer cùa ỉ h ì c III cùng cỏ li ong chủ ng vi khuẩn 5. Trong điều kiện phòng thí ngliiỌm, cluing tôi chỉ dừng lại ở bước thăm dò phương pháp linh sạch, clura có khả nfmjLi (li sâu nghiên cứu cấu trúc để có thể khẳng định kết quả một cácli chíic chim hơn.
IMi â n ( l o a n w
^ ___R ừ n _ --- ► « ---n f y--- ►
llitili 12: Sắc ký qua cột DBAE - xcnluloza cùa dịch cliict rliô. Đẩy gradient nồng ctộ 0 , 0 5 M 0.6M NaC’1.
4--- Rửa — --- Đẩy ---;--- ►
H ì n h 13: s ắ c ký qua cột D E A E - xenluloza củ dịch ctiiếl Iho. Đẩy lừng bước: 0,1M, 0,2M, 0,3M, 0,4M, 0.5M, 0 , 6 M
H ì n h 14: Phổ diện di của ADN
liên gel aaam /a dưới lác dụng
e n z i m các pliAn cloạn qiui CỘI
D E A E - Xenliiloza. /. Phân (loạn 24; 2. Phán (loạn 3 ì : 3. Phân (loạn 32; 4. Phân íĩoạti 33; 5. Phán (ỉoạn 43; 6. Phàn (loạn 51: 7. Phân (ỈOỌIÌ rì /.
ì Điện (li protein trên gel polyacrilamit có SI)S (SI)S - PA(ỈE>
Để (lánh giá mức (tộ tinh sạcli của clìế plnim e n / i m , ( bung lôi liến hành diện ell (lịch cliicl thô’ cùng các c h ế pluim e n / i m sau khi (|.ụ cạc bir.v sac ky lien gel p o ly a c r y la m it có SDS. Kết quả điện di (hình 15) Ilifly (01 Heparin sc pha roz a CL-6B có khả năng linh sạch e n / i m giới hạn vi kliuíỉn 5
có trọng lượng phân tử n ằ m trong kho ản g này? N h ư vậy, chế pliíun €1171111 dược tinh sạch m ộ t phẩn sau khi sắc k ý qua cột Heparin Sepharoza CL-6B và D Ẽ AE - Xeinluloza.
Kết q u ả của quá trình tinh sạch qua 2 cột sắc ký được thể hiện trên cót gel 5,6,7 (hình 15). Sau khi qua cột Sephacryl S-200, protein e n / i m được linh sạch sơ bộ nhưng dã loại bỏ được khá nhiều loại protein gắn cạnh tranh trốn cột Heparin Sepharoza CL-6B và D E A E - Xenluloza (cột gel 5). Cụ thể. s;’m
p h đ n i s ắ c k ý q u a c ộ t H e p a r i n S e p h a r o z a , đ ã q u a m ộ i h ư ớ c l i n h Si l t' ll CỊUÍ1 <-■<'(
Sephacryl S-200, cho một băng protein khá sắc nét chứng lỏ rằng ch cn7.ini
giới hạn vi khuẩn 5 tương đối linh sạch (cột gel 6). Băng protein liny nằm trong vùng có M W từ 66. 00 0 Da - 97.400 Da. C h ế phẩm enzim Síiu kl)i qua cột D E A E - X en lu lo za có 2 băng protein (cột gel 7), chứng lỏ rằng c hế pliẩm này có dộ tinh sạch k é m hơn so với c h ế ph ẩm qua CỘI heparin (cột gcl 6). Từ kết quả điện di trên gel polyacrylamit có SDS, chúng tòi cho lằng:
Nếu chỉ qua một bước linh sạch bằng sắc ký qua cột Hcp;irin Sepliaroza CL-6B hoặc D E A E - Xenluloza thì c h ế phẩm ch eii7.ini giới hĩMi
(lưực linh sạ ch m ột phẩn.
Q ua hai bước linh sạch: bước 1 dịch chiết thô được qua m l lọc gcl Sepliacryl S-200 và bước 2 d ịc h có hoạt tính (bước I) qua CỘI H eparin Sepluiroza CL -6B hoặc D E A E - Xenluloza, ch ế pliẩm cli er vi m giới hạn
t ư ơ n g đ ố i t i n h s ạ c h . K h ả n ă n g g ắ n d ặ c h i ệ u p r o t e i n e n z i n i v i klitKÌii 5 n e n CÓI
Heparin Sepharoza CL-6B tốt hơn so với cột D E A E Xenluloza.
2 3 4 5 6 7 H ì n h 15: Phổ điện (li proicin CHÍ1
clmng vi khuẩn 5 <|ua c;íc bước tinh s;u’h 21.5 kl ) a I U kDa 10 kl ),1 r-i / - Pi (’trill clìHÔn; 3 - C h í’ p h ẩ m RF. I Ị I K I ( òt Hcptiriì) S ep h a ro za CL-6IÌ:
4 - Cỉu~’ pìiám RE (ỊIKI < Ộ1 / ’/• \1‘ Xenluloza; 5 - C h ế p h ẩ m R E r/ihi c ộ t S r p ỉ h i n v/ S-200; 6 - C ỉ i ế p ỉ u i m R F Ì i v p t ì i i ĩ ì S c p h a t n-<t CL-6ỊÌ ị hước 2); 7 - C h i’ phôìii RF. < Ị H( I cột />/■ \f'. Xenlulo-d (Ỉn(ớc2). 15