Các ch ủn g vi sinh vật và xạ khuẩn dược pliAn lập từ bộ môn vi sinh vại, khoa Sinh học, trường Đại học khoa học lự nhiên, Đại liọc Quốc gi;i I ỉìì nội
2- INiuưng pháp nghiên cứu
- C á c chitnẹ vi sinh vật p h â n lập và được nuôi cấy liên mòi trưởng Isp 4 hoặc m ỏ i trường LB / 2 / .
- T á c h chiết enzim giới hạn
Các t ế bào vi sinh vật được tách ra khỏi đun g dịch nuôi cAy bằng cách ly tam 5 0 0 0 v/p trong 10 pluít ở 4° c . Loại bỏ dịch, thu cặn tế bào, sinh kliói vi sinh vật nếu chưa sử dụ n g được cất giữ trong tủ lạnh ở 4 ftc . Rứa tế bììo bring đệm piiỉí lế bào SB (10 m M Tris-HCl; 0,1 mM EDTA; lOmM 2- mercaploelanoi; 0,2% Trixton X-100; l m M NaN,: 5% glyxcrol: 5(>mM NaCI; pH 7,4 ơ 4 0 .
Dùng siêu Am để phá vỡ lế bào ở 0° c, 8 Amp, mỗi chu kỳ đ t a y siêu Am là 15 giây. Thời gian siêu lìm không quá 5 pluít dc bào vê hoạt tínỉi r ua en / i m .
L y tOm tlịch tế hào đã vỡ của vi sinh vật với loc dỏ I7.()()()v/p Imng 30 phúl (V 4 c . í hu (lịch chiếl rút lỉiô.
- Xác (lịnh hờm lượng pro tein ị 1 0 1
Đo (lộ Itflp thụ cua mãn ờ bước sóng 26 0n m và 280(1111 và tính tlicd ( Ang thức Hà m lượng protein = 1,55 X U D 2S(| - 0,77 X OIJy,,i
Pha loãng dịch chiết rút thô với các nồng độ khác nhau trong (limg dịch đ ệm phản ứng N E B 2 ( IO m M Tris-HCI; lOmM MgCỈ; 50mM NaCI: ImM LTĨT; pH 7,9 ở 25°C). Từ mỗi dung dịch đó lấy 30 |il cho vào 2 ị\\ Aí)NẰ chuẩn (500 |_ig/ml). Tiến hành ủ hỗn hợp piìản ứng ở 3 7° c trong 1 nọ! gif'^ Dừng phản ứng bằng cách sốc nhiệt ở 6 5 ° c trong 3 phút.
Từ dun g dịch phản ứng lấy ra 15 fil, thêm vào 2f.l1 thuốc MluiỌm (EI)TA 5 0 m M và bromophenol xanh 0,02% pha trong glyxerol 50%). c hAiìi điện (li để phát hiện các băng A D N được cắt ra nh ờ R E trong clịcli chi ỐI
+ Chuẩn bị gel agaroza và chạy điện di
Đ ệ m TBE 5X được chuẩn bị bằng cách cân 54g Tris-ba/ơ Vil 2 7 . Sg ;\xii boric, thêm 20inl E D T A 0, 5 M rồi dãn nước cất đến llít.
Từ 1 BE 5X pha loãng thành TBE IX dể đổ gel agaroza và chay đicn (li. Gel agaroza 0 , 8 % được chuẩn bị bằng cách đun sỏi 0.24 g ;ig;tro7M trong 30ml TBE IX. Để dung dịch agaroza nguội đến khoảng 6()MC lliì đỏ lổn khuôn gel đã cài sấn lược. Sau khi gel dông, cho gcl vào máy diện di, (lổ I BI7