- Chỉ số OD
2.3.1.Sác ký lọc gel qua cột Sephacr yl S-
Chúng lôi tiến hành tinh sạch một phàn bằng cách sắc ký qua cột Sephacryl s -200. Cột được cân bằng và rửa chiết bời đệm natii photphal 0,01 M (lOinM N a2H P 0 4, N a H2PG4; lOmM 2-mercaploelanol; O.l mM I-DTA: 5'r
glyxerol; 5 0 m M NaCl; pH 7,4) với tốc độ 15mí/h. Thu phAn đoan 2tnl v;i (1(1 0 D 2Sn cte xác. định hàm lưựng protein. Kếí quả thể hiệĩi ở hình I 1.
Kết quá thu được 3 dính protein tương ứng với các phân (.loan 5.11.19 dược gọi liì đính I, (lỉnh 2 và (.lính 3. Cluing tôi thửlioạl tính ờ dính lim (lươc với ADN Ằ. SítII khi diện di ticn gel agaroza (1,8%, kèt quá phán ứng <lư<«. Iltè hiện (V hình 12.
Phân đoạn
Hình 11. Sắc ký R E qua cột Sephacryl S-200
Kích thước C Ộ I : Ị ,0x56cm; Tốc độ chày:ì5mUh
Hình 12: Phổ điện di A DN trên gel agaroza cắt
bởi R E sau khi q ua cột Sephacryl S-200
I : Phàn ứng ớ dinh I
2: Pha lì Ínií> à dinh 2
C h ún g tôi lấy mỗi phân đoạn đỉnh 2|_il làm phản ứng, kết qua trên hình 12 cho thấy đỉnh 1 (phân đoạn 5) và đỉnh 2 (phân đoạn 14) có hoạt tính cất A D N X điều này làm cho chú ng tôi nghĩ đến khả năng đỉnh hoạt tính nằm giữa hai đỉnh protein trên. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục thực hiện phản ứng của các phân đoạn 4, 6, 8, 10, 12 15, 17 cắt A D N X nh ằm phát hiện các phân đoạn chiết rút qua cột Sephacryl có hoạt tính R E (hình 13).
1 2 3 4 5 6
Hình 13: Phổ điện di của A D N X trên gel agaroza dưới tác dụng cua RE các
phân đoạn sau khi qua cột Sephacryl S-200
I - Phản ứng à phân đoạn 4; 2 - Phàn ứng ở phún đoạn 6; 3 - Phàn ứng ờ phân đoạn 8; 4 - Phản ứng ớ phân đoạn 10: 5 - Phàn ứng ở phân đoạn 12; 6 - Phán ứng à phán đoạn /5 7 - Phàn //7/1? ở phàn đoạn 17.
Nh ư vậv ứ phân đoạn 4 (trước đỉnh 1) ADN Ằ không bị cắt v;ì hiếu hiện thành 1 vệt sáng trên cột gel 1. Ở các phân đoạn 6, 8. 10. 12 (giữa đinh I và 2) sản phẩm phíìn cắt AD N A. thể hiện rất rõ. Kếl quả nàV clnmg minh dư đoán trên cua chú ng lôi là đúng. Ở phân đoạn 15. 17 (sau dinh 2) tương ling với CỘI gel 6 và 7 VÃI1 có những vạch giớ i hạn nhưng mờ hơn, xen vào đó !à những vạch m ờ hơn nữa. Điều này cho thấy, ở những phAn đoạn niiy RR và endonucleuza không dặc hiệu cùng hoạt động. Hoạt tính RH giảm drill và mill ớ những phím đoạn sau. Các phan đoạn có lioạl tính liên được đổn lại (lò XIÍC định prolein. Q ua kêì quả thu dược sau khi sắc ký qua CỘI lọc gel S c p h a a vl S- 200 cluing lôi nhận thấy đỉnh hoại tính xuống cột khá nhanh, có (hố i;lng protein e n / y n i này có trọng lượng phân lử lớn?. Qua cột lọc gcl. Rí: (lã phrin
!ÙU> (lược tách khỏi các nucleaza kliông đặc hiệu. N ha m thăm dò s;'m hơn C|uy
(rình này, cluing lồi liếp lục tinh sạch phế phẩm bằng hai Ciídi: Mội pliỉiĩi qua
cột sắc ký ái lực Heparin Scpharoza và mội phán qua CỘI (lao dổi ion DIÍAI’
Xcnhilo/H.
2 .3 .ỉ . Ị . S ắ c k ỷ á i ìu c q u a cột H e p a r in S e p h a r o z a C L - 6IỈ
D ị c h c o l i o ạ l t í n h s a u k l i i q u a c ộ t S c p h a c r y l s 2 0 0 ( l ư ợ c I! C|1 II 1C l i n h
sạch b ằ n g p h ư ơ n g p h á p sác k ý ái lực. C ộ i dược c â n bíín g hcVi đ ệ m Ị l ỉ ( l O n i M Tris-MO: lOmM 2-meicaptoetanol; O.ỉ mM EDTA; 5'.í glyxcicl; 5(>mM
N a C f ; p ỉ l 7 ,4 ). Síìi! k h i r ử a p h i ì n k h ô n g h ấ p p h ụ t r ê n c ộ t . p h í l n h A p p h ụ tUr<Tc
(lẩy hang gmdicnl nồng dọ NaCI pha trong dèm TB tu n.n.s M - IM. ' I hu 111"!
phfm đoạn í nil (lể plifln tích protein và hoạt tính phân cắt A D N . ( V)! (Iirực t h ay
trong điếu kiện lạnh dc bảo đám hoạt tính cua enzym. Kct <|IKÌ ỉlin (ỉiriíc Mint * (lỉnh prolcin duy nhát (hình 1 I). Protein liên kết dặc hiệu với l i q w i n ớ pH
sinh lý. Đê Iníiili nlũmg lifting lác ion không dặc hiệu, đệm licn kct phíii l ó ÍI 'iliát 0 15M N a O . Tuy nhiên, nếu protein mà ta quan lãm lien kct V(VĨ hcpaiin luc trad dổi cation thì (lcm liên kêt pliài có !ực ion yen. RE CIKI vi kli!i;in
5 b á m trên cột heparin bằng tương tác ion. Vì vậy, chúng tôi dùng gradient nồ n g độ NaCl từ 0 ,0 5 M - I M để đẩy sau khi đã rửa sạch hết tạp chất (OP280—0).
C hú ng tôi thực hiện phản ứng của các phân đoạn bá m trên cột với A DN
X. Kết quả biểu hiện ớ hình 14 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phân đoạn
4 — R ử a---► 4--- - Đẩy---►
Hình 14: s ắ c ký qua cột Heparin Sepharoza LC-6B của dịch sau khi qua
1 2 3 4 5 6
V
ỷ :.
k •*.
ặ ' 'Ị
H ì n h 15: Phổ điện di của ADNÀ trên gel agaroza dưới tác dụng của các phân đoạn en zym qu a cột Heparin Sepharoza C L6B.
/ - Phản ứiiỊ> (ý phún đoạn 9; 2 - Phàn ứng ờ phan doạn 10; 3 - Phán ứng ớ phán đoạn I I ; 4 - Phàn ứng ờ phân (Joan 13; 5 - Phán ứng ớ phân đoạn 15; 6 - Phàn ứng ớ phân đoạn 17
Kết quả cho thấy, ở phân đoạn 9,10,11 có hoạt tính cua RE được đấy ra ở nồng độ NaCl 0,1 5 M - 0,2M, phân đoạn 13, 15, 17 ADNẦ đã bị cất nát tạo thành vệt sáng dưới đèn tứ ngoại. Chúng tôi cho rằng, sau khi qua cột Heparin Sepharoza CL - 6B, R E đã được tinh sạch khá nhiều. Tuy nhiên, đế so sánh sản phẩ m tinh sạch sau khi qua cột Heparin Sepharoza C L -6B với san phấm tinh sạch sau khi q ua cột D E A E - Xenluloza từ dịch có hoạt tính từ cột Sephacryl s -200, chúng tôi tiếp tục tinh sạch sản phẩm qua cột D E A E - Xenluloza.
2.3.1.2. Sắc ký trao đổi ion qua cột D E A E - Xenluloza
Lấy 15ml dịch q u a cột Sephacryl s - 200 cho lên cột D E A E xenluloza có kích thước l , 0 c m x 8, 0cm đã được cân bàng với đệm TB. Đế tránh làm mấl hoạt tính enzyrn chú ng tôi tiến hành chạy sắc ký trong điều kiện lanh 4"c. Sau
khi rửa phần k h ôn g hấp phụ trên cột, phần protein không hấp phụ thì được đẩv bằng các nồng độ NaCl 0,1M; 0,2M; 0,3M; 0,4M; 0,5 M và 0.6 M pha trong đệm TB. Thu phân đoạn 2ml với tốc độ 15ml/h sau đó đo O D trên m áy quang phổ ở bước sóng 28 0 n m ( O D 280) để xác định h à m lượng protein có trong dung dịch thu phân đoạn.
Hình 16: s ắc ký qua cột D E A E - Xenluloza của dịch enzym
sau khi qua cột Sephacryl s - 200
Kính thước cột: ỉ xScm; Tốc độ chày: Ỉ5ml/h; Đém TB pH 7.4; Thê tích mỏi phân đoạn 2 mì. Đẩy bang NaCỈ với cúc nống độ 0,1 M, 0,2M, 0,3M,
0.4M. 0,5M, 0,6M.
Kết q uả thu được 6 đỉnh protein trong đó đỉnh protein được đẩy xuống
m cột ở nồ ng độ 0, 2 M có hoạt tính mạ nh (hình 16, 17). Đỉnh protein thứ 1 bị đáy ở nồng độ NaCl 0,1 M có h àm lượng protein lớn nhất (hình 17, cột gel 2, 3) có hoạt tính R E nhưng yếu hơn. N hư vậy rất có thế có khả năng tồn tại 2 loại i so sc hi zom er trong chủ ng vi khuẩn này, cũng có thể rằng enzym này b ám trên côt với lưc ion yếu nên đã bị đẩy một phần ngay ở nồng độ muối 0 , I M . Các
phân đo ạn đỉnh 49, 60, 68, 74 bị đẩy ở các nồng độ muối tương ứng 0,3M, 0,4M , 0,5M, 0, 6 M đều thể hiện 1 vệt sáng trên gel điện di do ADNÂ đã bị các nucleaza k hô n g đặc hiệu cắt.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
H ì n h 17: Phổ điện di của A D N trên gel agaroza dưới tác dụng của enzym các phân đoạn qua cột D E A E - Xenluloza
Ị - Phun ứng ở phân đoạn 13; 2 - Phàn ứng ở phàn doạn 3 Ị ; 3 - Phán ứng ở phân đoạn 32; 4 - Phàn ứng ớ phún đoạn 38; 5 - Phán ứng ở phán đoạn 39: 6 - Phàn ứng ờ phán đoạn 40; 7 - Phán ứng à phán đoạn 49; s - Phán ứng ở phún tĩoựn 60: 9 - Phàn ứng ở phún đoạn 68; 10 - Phàn ứng ở phùn đoạn 74. • C h ủn g tôi nhận thấy ràng hoạt tính enzym của chứng vi khuẩn 5 khá
mạnh trong dịch chiết thố (ở độ pha loãng cao vẫn còn hoạt tính). Theo nhiéu tác giả chỉ bằng 1 bước tinh sạch có thế thu được c h ế phẩm RE thương mại. Theo tác giá Pich MT.Somkuti GA (1995), một ioschizomer cua H a elU là Saơl tách từ ch ủn g S trepto co ccu s agalactiae đã được tinh sạch chí qua 1 cột
sắc ký. RE nhận đưực có hoại tính rất cao, hoại động cúa nucleaza không tliìc hiệu hoàn toàn bị loại bỏ. Nhằĩn tìm hiểu khả năng tinh s ạ c h RE t ừ vi khuân 5. chúng tòi liên hành sắc ký dịch chiết thô qua cột Heparin Sepharo/ỉi ( [. Mỉ và D E A E - X en lu lo /a với những diều kiện sắc ký như đã trình b à y liên
2.3.2. Sắc k ý ái lực qua cột Heparin Sepharoza CL - 6B
Lấy 2 nil dịch chiết thô cho qua cột Heparin Sepharoza CL - 6R kích Ihước 0,5cm X k-m và dược cân bằng bằng đệm TB. Sau khi rứa pliíìn không liâp phụ lên CỘI phần hấ p phụ được (lẩy bàng gradient nồng (1ọ NaC'1 phí) tmng dậm I Í3 từ 0.05 M - 1M (hình 18,! 9).
^ __ R ứ a --- ► 4---t ó y ---^
Phím rloan (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2 3 4 5 6 7
H ì n h 19: Phổ điện di của A D N trên gel agaroza dưới tác dụng của các phân đoạn qua cột Heparin sepharoza CL6B
/ - AD NÀ cắt bài RE dịch chiết tliô; 2 - Phán ứnẹ à phún líoạn 4;
3 - Phán ứng à phân đoạn 15; 4 - Phán ứni> ớ phân LỈoạn 17 ;
5 - Phàn ứng à phán đoạn 19; 6 - Phan ứng ớ phán đoạn 21 ; 7 - Phản ứng ừ phún đoạn 23.
N h ư vậy, qua kết quá ở hình 15, 16 chúnơ tôi thấy răng phán đoạn 17 (đỉnh hấp phụ) có hoạt tính RE bị đẩy xuống ớ nồng độ muối tương đương với lần thí ng hi ệm trước là 0,1 5M - 0,2M. Đỉnh này chiếm một lượng protein không lớn so với tổng lượng protein có trong dịch chiết thô. C h ú n s tôi cho rằng cột Heparin Sepharoza CL-6B cho phép RE chủng vi khuẩn 5 bám đặc • hiệu.