- Chỉ số OD
2.2 .4 Định loại enzym giới hạn
Trong sô 20 chủng vi sinh vật do Trung tâm Vi sinh vạt học cung câp. chú ng tôi đã diều Ira sơ bộ trên dịch chiết thô và nhận thấy chủng vi khuẩn 5
có hoạt tính của RE. Chúng tôi tiến hành xác định xem RE cua chúng vi khuẩn 5 là c n / y m mới hay đồng nhện biết với R E nào. Nguycn tắc cơ liíin (tê xác định một cnzym giới hạn là dựa trên sự phan tích những bilPịi lạo ra khi cnzym cắt các A D N chuẩn (ADNẰ, <Ị)XI74, pUC I !8) và so sánh \(Vi những hăng của en/.vrn (lã được biết. Trường hợp các băng hoàn toàn giõĩm với I11ỘI c n / y m dã biết thì C'ó thể kết luận enzym phỉìn tích In enzyin dồng ĩihOn hiêl (isoscliÍ7.omcr) cùa en zym giới hạn đó. Nói chung, (la sô' c n / y m lìm (lirơc líi i s o s i h i / o m c r cua enzvin giới hạn dã quen biết cớ nghĩa !à nliận la rimii Irìnli (ự đặc hiệu. Nliững isoschizomer tuy xúc tác phán ứng cắt ớ vị Iií có cung trình tự nulcotit nhưng chúng có cấu trúc phân tử khác nhiui vì XIKÌI phát tir nliững loài vi khuẩn khác nhau.
1 2 3 4 5 6
H ì n h 9. Phổ điện di của A D N X cắt bởi các en zym giới hạn
1 - Hind III + EcoRJ cất AD N Ã: 2 - XI10 I cắt AD N Ả ; 3 - Hue III cát AD N Ả; 4 - BưmHX cút AD N Ả;
5 - Hind III cát AD N Ã; 6 - Enzxm phán tích cat AD N Ả.
Đối chiếu phổ điện di của enzym phân tích từ chủng vi khuẩn 5 với các băng của H u e III chúng tôi thấy chúng hoàn toàn giống nhau. Theo BioLabs
H u e III là m ộ t RE cắt ADNẰ tại 149 vị trí, cắt ỘX174 tại ] 1 vị trí do vậy sẽ có rất nhiều băng có kích thước nhỏ trên phổ điện di. Trong đicu kiện thí nghiệm của chú ng tỏi chỉ phát hiện tới 10 băng có kích thước như hình 9.
Đế kh ẳn g định chác chắn điều này chúng tỏi tiến hành thí nghiệm so sánh 3 phản ứnq cùng một lúc: enzyrn đang nghiên cứu cắt ADNÂ: enzym chuẩn cắt ADNÀ và ca 2 en zym cắt ADN/.. Kết quá thế hiện ứ hình 10.
1 2 3
vít
sr. ^v-f" ■: ' '/M^ẩịỂẳý
H ì n h 10. Phổ điện di các loại A D N cắt bởi enzym giới hạn. /. Euzym nghiên cứu cắt AD N Ả.;
2. Enzym nghiên cứu + Hae /// chuẩn cất ADNẢ. 3. Hue III chuun cát AD N Ẳ.
4. Hae III chuẩn cắt ỘXỈ74;
5. Enzym nghiên cứu + Hae ỈU chuẩn cắt ỘXI74; 6. Eniym ỉìiịhién cửu cát ỘXI74
7. Enzym nẹhién cứu cắt pUC ỉ 18;
8. Enzym nghiên cứu + Hue ỉỉ ỉ cliuấn cắt pUC ] 18;
9. p ư c ỉ 18
Q u a kết quá trên, chúng tồi thấy: 3 cột gel 1, 2. 3 hoàn toàn giống nhau, • có thê ch ồn g khít lèn nhau, nghĩa là enzvm phân tích và H u e III chuán cắt ADNA. cùn g các vị trí. Vì vậy, chúng tỏi hoàn toàn có thỏ kết luận rãng enzvm phân tích là một isoschizomer với H a c III. Ngoài ra, chúng tỏi thực hiện phán ứng với các cơ chất khác nhau: (Ị)X174. pUC 118 cũng cho kết qua tương tự. T he o BioLabs thì H u e III có trình tự cắt như sau:
3 ’CC G G 5 '
Do vậy RE ớ chúng vi khuẩn 5 cũng có trình tự Iiliộn biêl \;i vị 11í ( Tít nlur liên.
2.3. T H Á M D Ò r i I Ư O N C Ỉ P H Ả I ’ T I N H S Ạ C H ENZYI W <;icÍI II \ N
Những phái hiện CỈÀU liên vé RB dã m ỏ ra lurớng (ỉiổn I ta clini! nhir nghiên cứu s;ìu hơn loíii ciizym này. Cho den nỉim 1 c>74 Tiifti có .10 Rf : (lirơc công bố (Roller!, 1974). Khoảng 10 năm .sau đó dã có 398 RE tlirnc linlt 'vkli t)c liứ Ihìmli chê phẩm ihutíiie mạ ị SỪ dụng trong cniiíi n li hệ sinh line (lint! như sinh học’ phân t ử , RF, pliíii (lược tinh sạch hoàn loàn, Tnỳ lluinr víin 1ƯI1U
loa i Rf:. và I ỉn Vi’ cluing vi sinh vật mà RE phái phái I|iia nhiều lnrứ( linli s;u li hay chí nu)! bước (inh sạch. Theo điểu tra của Lc Thị Kim Tuycii. c;U (lịch chict Ihò cua chú ng có chứa enzvm gitVi hạn qua cò! SÍK’ ký ;ii 111C’ llcpaiiti Sephaio/.e, cô! Irao dổi ÌOT1 D E A E - Sepharoza hoặc Pholplioxcnliiliv;i ỈM I. Kết (Ịiiá chí ra lar.g da sỏ enzym có thể tinh sạch ờ uic cột trên. c III trẽn lìiòl dối lương lù ! 'j o R \ được tách từ E. coll RY13. dã co nlik'11 còne Iiìnli <lir<í(. còng ho. (ìiecne, Betlach. G o l d m a n và Roycr (1974) (lã linh SÍỊCỈ1 /•( (>K\ (|ii;i 4 cộ! site ký: Phoiplioxcnlulo/a. 1 lytlroxvlapaiil. DHAIÌ - Xcnhilo/;i. Sc|'li;ul('\
( ì -1(10. P c t c r .A . L u k e và Stephen n .H a lf c >rcl (19<S5) cìã Míihiên cứu nmv (In linìt
lan t ua R l í n ày ờ n lu ìn g uổng đọ N a C I k hác Iitiau. Iilticl (lo |'li;m líni! k liiK
nhau và linh sạch qua 2 cột sắc ký Pholplioxenlulo7a và I lydmxyapỉilil. Mclua. Malliolra, R c m bo h ol k ar ( 1 T O ) cho rằng. tie ỉũ'oR\ Irớ thinih Ihimng pham lliì kliõng the tinh sạch qua IÌ1ỘI bước sác ký mil nliâl lhk’1 pliiii có sư phối hợp á m CibíKTOiì Fỉluc-Ĩ;3 GA - a g a n v a và Hyclm.xyapiilil.
Trong điều kiện hiện c ó của phòng t h í nghiệm chúng t ô i tliíìy rằng LÓ
Ihé sử d ụ n g cột sắc ký Sephacryl s - 200 để bước đầu linh sạch RR cùa d ú m g vi khuẩn 5.