- Bảo quản dịch chiết thô
15 phút ở 0°c.
-Phương pháp xác định độ phá vỡ tế bào vi kliuẩti bởi li/07Ím: + Xác địnli độ dục trước và sau khi có lizozim.
Lấy 100 J.il dịch tế bào, cho thêm 800 ịx\ dệm ĩ ris-ĩ ÌC I 10 mM. pll K.o và 200 Ị.il d u n g dịch lizozim 1,5 mg/ml. Đo O D ở bước sóng 660 mu hước và sau khi cho lizoziin. ủ ở nhiệt độ lạnh Irong 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 v;t 4.0 giờ
+ X ác clịi.h (lộ phá vỡ ( ế b à o trước và sau khi cho li /o /i m.
2r Phương pháp nghiên vứu
- Ch uẩ n bị dịch tế bào như phán xác định độ dục. Pha loiìiig lé b;u> « r;íc nồng (lò 10 2 10 1 và 10 ‘r’ . 1 Ẩ y 99 0 ụ\ nước cất, cho lliêni 10 III (lit h lê
(;i), pha loãng (lịch a bằng cách lấy 990 ụ] nước cất rồi clio lliê.n 10 fil (lịch
à (h), liếp lục plKì losing, 1 Ay 9 9 0 ịi\ nước cất cho them l í ụ i l (lịch b «•). I Av 5 ill dịch c (10 -°) cấy dề 11 lên đìa Ihạch, ù ở 37 "c. Đ ém so lương lê bìm
-Pliản ứng CIU1 enzitii giới hạn cổ sự tham gia cun li 7.07.1 111.
U y 5 ốn g Hgliiiệm, cl,o 25 nl đệm pliản ứng TR (Tris-IICl 10 n,M. p!l
7,5 N í ì n 50(11 M M g ơ 3 10 n i M , p -mercí ipt oct ano! 10 m M . clio s;u. khi 'ir>
mM E D T A , pH 8,0, 0,02 % bromop he nol blue).
- Phản ứng với enzim giới hạn dịch chiết thô (phá bằng siêu Am) cổ và không có lizozim.
+ Cliuíỉn bị du ng dịch lizozim: Dung dịch có nồng độ 0,3, 0,2, 0,15 và 0,10 ing/ml với đ ệm Tris-HCl 10 mM , pH 8,0.
+ Phản ứng : Dùng 5 ống ng h iệ m đánh dấu từ 1 đến 5. Cho 40 Ị.il ciệin NB vào ống 1, 30 Ịil vào ống 2, 3, 4 và 5. Cho 5 dịch chiết thô vàn ống 1, trộn đều. Lấy 15 |.il dịch từ ống 1 cho sang ống 2, trộn đều. Lây 15 |.il dịch từ ống 2 cho sang ống 3, tiến hàn h tiếp tục đến ống 5. Ông 5 bỏ di 15 Ịil dịch. Như vây mỗi ốn g n g g h i ệ m có 30 Ị-il dung dịch có nồn g độ dịcli chiết (hổ tuơng ứng 1/9, 1/27, 1/81, 1/243 và 1/729. Cho vào mỗi ống: 2 fil ADN X
hoặc A D N '17, 3 Ị-il d u ng dịch lizozim lừng loại nồn g dô, ống dối cluing không có lizozim, ử ở 37 ° c trong 1 giờ. Cho tiếp 10 Ị_il dung dịch ngừng phản ứng (stop dye).
- Điện di trên gel agaroza.
Gel agaroza 0,7 %, dày 3-4 mm. Cho vào mỗi giếng 15 dung (lịch cun mỗi ống nghiệm, đối chứng là m ẫu A D N X căt bởi H in d III, diện áp 100 V. Khi kết Ihíic điện di, bản gel được n h u ộ m với etidium bromit (10 nigẠil ). Các băng A D N được phát hiện và chụp bằng ảnh Polaroid.