Phương pháp nghiên cứu

Một phần của tài liệu ách chiết, tinh sạch và nghiên cứu tính chất một vài Endonucleaza giới hạn từ các nguồn vi sinh vật của Việt Nam (Trang 77)

I, Nghiên cứu sử dụng lizozim phá màng tế bào vi khuíỉn để tách cliiêt enzim giới hạn

2- Phương pháp nghiên cứu

- N u ô i cấ y vi kh u ẩ n : C h ủ n g vi kh uẩn 5 được nuôi cây trong mối trường dịch

the lo n g L B / / /

- T h u nhận c h ế p h ẩ m

+ Tá ch chiết enzim vi sinh vật từ môi trường nuôi cấy

Ly lAin dịch nuôi cấy 5000 v/p trong 10 phút ở 4° c. Thu lấy cặn tế bào. Rửa tế ba o bang đ ệ m phá tế bào SB ( lO m M Tris-HCl; ( U m M EDTA: ỈOmM 2- mercaptoelanoi; 0, 2% Trixton X-100; I m M N a N ?: 5% glyxerol; 50niM NaCI; pH 7 , 4 Ở 2 5 ° C ) . D ù n g s i ê u A m đ ể p h á v ỡ t ế b à o ở 0 ° c , 8 A m p , vớ i c h u k ỳ l à 1 5 g i A y v à s i ê u âm k hô ng qu á 5 phút L y t a m d ị c h t ế b à o v ớ i t ố c đ ộ ] 7 . 0 0 0 v/ p t ro n g 3 0 p h ú t ở 4 ° c . T h u đ ị c h c h i ế t rút thô. 1

thức

H à m l ư ợ n g p r o t e i n = 1 , 5 5 X O D 2 8 0 - 0 , 7 7 X O D 2 6 0 (m g / m l )

+ Sắc ký lọc gel q u a cột Sephacryl S-200

Gel ở dạn g trương sẵn dược nhồi lên cột có kích thước ( 1 ,0x60cm). Cân bằng và rửa chiết cột b ằ n g đ ệm NB (10 m M N a 2H P 0 4- N a H 2P 0 4; 0,1 m M EDTA; lO m M 2 - mercaptoetanol; 5 % glyxerol; 50 m M NaCl; pH 7,4). Thu mỏi phân đoạn 2 ml với tốc độ ch ảy 15ml/h. Đ o độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm và thử hoạt tính phân cắt A D N của enzi m các phân đoạn.

+ S ắ c k ý t r a o đ ổ i i o n q u a c ộ t D E A E - X e n lu l o z a [ 8 J

C h ế ph ẩm enzi m cần tách chiết được đưa lên cột D E A E - Xenluloza đã được cân bằng bởi đ ệ m TB ( l O m M Tris -HClị 0 , l m M EDTA; lOmM 2- mercaptoetanol; 5% glyxerol; 5 0 m M NaCl; pH 7,4).. Phần protein khống hấp phụ dược rửa bằng đ ệ m TB với tốc độ chảy 15m]/h. Phần protein hấp phụ được rửa chiết bằn g các nồ ng độ NaCl từ 0,1 M - 0,6M. Tiến hành thu phân đoạn 2ml để phân tích protein và hoạt tính phân cắl AD N của enzim. Cột được chạy trong điểu kiện lạnh để đ ảm bảo hoạt tính của enzim

+ Sắc ký ái lực q ua cột Heparin Sepharoze CL - 6B [3]

Heparin Sepharoza dạ n g bột khô được ng âm trong đệ m TB rồi nhồi lên cột có kích thước (0,5 x3c m) . C h ế p h ẩ m enzim cần tách chiết được đưa lốn cột. Phần protein k hôn g h ấp phụ được rửa chiết bằng gradient nồng độ NaCI từ 0,05 M

- 1 M. Tiến hành thu phân đoạn l m l để phân tích protein và hoạt tính phân

cắt A D N củ a enzim. Cột được chạy trong điều kiện 4 - 6 " c để đ ảm bảo hoạt tính củ a en zim

- X ác địnlì lioạt tính phân cắt A D N của enzim gi(íì hạn bàng phương pháp điện (li trên gel agaroza [11]

+ Thực hiện phản ứng

Plui loãng dịch chiết thô với đệm phản ứng N E B 2 [14J tới các nồng độ klìác nhau. L à m phản ứng với A D N X chuẩ n ở 3 7 ° c trong một giờ. Sau đó diện di trên gel agaroza 0,8%.

- X á c định độ tỉnh sạcli của ch ê p h ẩm enzim

C h ế plìẩin en zi m sau khi qua cột được xác định độ tinh sạch bằng chạy diện

đ i g e ! S D S - p o l y a c r y l a m i t v ớ i t h à n h p h ầ n g e l t á c h l à 1 2 , 5 % v à g c l c ô l à 4 , 5 %

[8] N h ộ m gel với C ô m as ie Blue G 2 5 0 [5].

Một phần của tài liệu ách chiết, tinh sạch và nghiên cứu tính chất một vài Endonucleaza giới hạn từ các nguồn vi sinh vật của Việt Nam (Trang 77)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(139 trang)