I, Nghiên cứu sử dụng lizozim phá màng tế bào vi khuíỉn để tách cliiêt enzim giới hạn
2- Phương pháp nghiên cứu
- N u ô i cấ y vi kh u ẩ n : C h ủ n g vi kh uẩn 5 được nuôi cây trong mối trường dịch
the lo n g L B / / /
- T h u nhận c h ế p h ẩ m
+ Tá ch chiết enzim vi sinh vật từ môi trường nuôi cấy
Ly lAin dịch nuôi cấy 5000 v/p trong 10 phút ở 4° c. Thu lấy cặn tế bào. Rửa tế ba o bang đ ệ m phá tế bào SB ( lO m M Tris-HCl; ( U m M EDTA: ỈOmM 2- mercaptoelanoi; 0, 2% Trixton X-100; I m M N a N ?: 5% glyxerol; 50niM NaCI; pH 7 , 4 Ở 2 5 ° C ) . D ù n g s i ê u A m đ ể p h á v ỡ t ế b à o ở 0 ° c , 8 A m p , vớ i c h u k ỳ l à 1 5 g i A y v à s i ê u âm k hô ng qu á 5 phút L y t a m d ị c h t ế b à o v ớ i t ố c đ ộ ] 7 . 0 0 0 v/ p t ro n g 3 0 p h ú t ở 4 ° c . T h u đ ị c h c h i ế t rút thô. 1
thức
H à m l ư ợ n g p r o t e i n = 1 , 5 5 X O D 2 8 0 - 0 , 7 7 X O D 2 6 0 (m g / m l )
+ Sắc ký lọc gel q u a cột Sephacryl S-200
Gel ở dạn g trương sẵn dược nhồi lên cột có kích thước ( 1 ,0x60cm). Cân bằng và rửa chiết cột b ằ n g đ ệm NB (10 m M N a 2H P 0 4- N a H 2P 0 4; 0,1 m M EDTA; lO m M 2 - mercaptoetanol; 5 % glyxerol; 50 m M NaCl; pH 7,4). Thu mỏi phân đoạn 2 ml với tốc độ ch ảy 15ml/h. Đ o độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm và thử hoạt tính phân cắt A D N của enzi m ở các phân đoạn.
+ S ắ c k ý t r a o đ ổ i i o n q u a c ộ t D E A E - X e n lu l o z a [ 8 J
C h ế ph ẩm enzi m cần tách chiết được đưa lên cột D E A E - Xenluloza đã được cân bằng bởi đ ệ m TB ( l O m M Tris -HClị 0 , l m M EDTA; lOmM 2- mercaptoetanol; 5% glyxerol; 5 0 m M NaCl; pH 7,4).. Phần protein khống hấp phụ dược rửa bằng đ ệ m TB với tốc độ chảy 15m]/h. Phần protein hấp phụ được rửa chiết bằn g các nồ ng độ NaCl từ 0,1 M - 0,6M. Tiến hành thu phân đoạn 2ml để phân tích protein và hoạt tính phân cắl AD N của enzim. Cột được chạy trong điểu kiện lạnh để đ ảm bảo hoạt tính của enzim
+ Sắc ký ái lực q ua cột Heparin Sepharoze CL - 6B [3]
Heparin Sepharoza dạ n g bột khô được ng âm trong đệ m TB rồi nhồi lên cột có kích thước (0,5 x3c m) . C h ế p h ẩ m enzim cần tách chiết được đưa lốn cột. Phần protein k hôn g h ấp phụ được rửa chiết bằng gradient nồng độ NaCI từ 0,05 M
- 1 M. Tiến hành thu phân đoạn l m l để phân tích protein và hoạt tính phân
cắt A D N củ a enzim. Cột được chạy trong điều kiện 4 - 6 " c để đ ảm bảo hoạt tính củ a en zim
- X ác địnlì lioạt tính phân cắt A D N của enzim gi(íì hạn bàng phương pháp điện (li trên gel agaroza [11]
+ Thực hiện phản ứng
Plui loãng dịch chiết thô với đệm phản ứng N E B 2 [14J tới các nồng độ klìác nhau. L à m phản ứng với A D N X chuẩ n ở 3 7 ° c trong một giờ. Sau đó diện di trên gel agaroza 0,8%.
- X á c định độ tỉnh sạcli của ch ê p h ẩm enzim
C h ế plìẩin en zi m sau khi qua cột được xác định độ tinh sạch bằng chạy diện
đ i g e ! S D S - p o l y a c r y l a m i t v ớ i t h à n h p h ầ n g e l t á c h l à 1 2 , 5 % v à g c l c ô l à 4 , 5 %
[8] N h ộ m gel với C ô m as ie Blue G 2 5 0 [5].