- Bước 2: Gắn sản phẩm II vào cơ chất AH2 ở dạng khử.
- Bước 3: Khi cơ chất ở dạng oxy hóa đồng thời có nồng độ H2O2 cao thì một phân tử H2O2 tiếp theo sẽ tham gia vào phản ứng:
Từ phức hợp III sẽ phân ly thành: phức I + H2O + ½ O2
Khi nồng độ H2O2 thấp (không quá 109 M) thì cơ chất sẽ tham gia phản ứng, tức peroxydaza hoạt động. Nếu nồng độ H2O2 cao, peroxydaza sẽ phản ứng theo bước 1 và bước 3 không có sự tham gia của cơ chất.
Theo Back, peroxydaza có vai trò quan trọng bậc nhất đối với các quá trình chuyển hoá sinh học xảy ra trong cơ thể: Enzym này xúc tác cho sự oxy hóa không những bởi H2O2 mà còn bởi các peroxyt hữu cơ khác. Nó có thể sử dụng cả peroxyt của axit béo không no tạo thành dưới tác dụng của lipooxydaza và peroxyt của carotenoit. Polyphenol
F e F e F e F e O H O H H O H O I + H 2O 2 F e F e F e F e O H O H O H O O H + H 2O H O F e F e F e H O F e O H O O H I I + A H 2 F e F e F e F e I O H O H H O H O + A + H2O
ở trạng thái tự do cũng như ở dạng glycozit, đều là những cơ chất phổ biến của các peroxydaza thực vật [10].
* Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm hoạt động của enzym peroxydase máu người theo theo phương pháp E. xavron [10].
Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở xác định tốc độ phản ứng oxy hóa indigocarmin bằng
H2O2 trong môi trường axit yếu khi có mặt của enzym peroxydaza máu người.
Trong thí nghiệm này sử dụng peroxydaza thuộc nhóm máu A, B, AB và O và xác định ảnh hưởng của polyphenol lên phản ứng oxy hóa indigocarmin. Thông qua sự thay đổi hoạt độ enzym khi có mặt của các dịch chiết khác nhau từ thực vật.
Tiến hành:
Vật liệu:
- Máu tươi được chống đông bằng ADC, pha loãng 500 lần bằng dung dịch NaCl 0,9 %.
- Chất thử pha trong DMSO 100 % thêm vào sao cho đạt nồng độ 128 μl; 32 μl; 8 μl; 2 μl; 0,5 μl và nồng độ DMSO trong phản ứng không lớn hơn 1 %. Sau đó được pha trong dung dịch RB trên đĩa elisa thứ 2. Đĩa thứ 3 là đĩa phản ứng.
Phản ứng: Lấy 10 μl chất thử từ đĩa RB vào mỗi giếng rồi lấy thêm vào mỗi giếng các chất sau:
- 60 μl đệm axetat natri pH 4,7 0,1N
- 60 μl pha loãng 500 lần sau khi lấy ra khỏi tủ lạnh sâu. - 60 μl H2O2 0,2N
- 20 μl Indigocarmin 0,001 N chỉ pha trước khi dùng.
Riêng các giếng Ctr- không có enzym, thay enzym bằng dung dịch đệm. Điều khiển âm không có enzym, điều khiển dương enzym hoạt động 100 %. Để thời gian phản ứng 20 phút, đọc kết quả ở bước sóng 610 nm.
Xử lý kết quả:
Tính hoạt động của enzym peroxydaza (AE %) theo công thức sau: AE % = [ODctr- - ODtest ] / [ ODctr- - ODctr+ ] x 100 %
% kìm hãm hoạt động của enzym được tính bằng công thức: IC = 100 − AE % (%)
Giá trị IC nồng độ ức chế 50 % hoạt động của enzym được tính dựa trên đồ thị điểm của giá trị IC ứng với từng nồng độ của chất thử trong phần mềm Excel.