lượng trong môi trường lỏng
Nguyên tắc: chủ yếu cũng như kĩ thuật hòa loãng 2 lần liên tiếp nhưng phải có dàn máy ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay: Thử nghiệm miễn dịch gắn enzyme) nên hiện đại hơn, nhạy hơn, nhanh hơn, tự động, tiết kiệm và có tính định lượng cao hơn so với kĩ thuật hệ nồng độ thông thường ở những điểm sau:
Kĩ thuật thông thường chỉ dùng một hoặc một vài dãy thí nghiệm, trong khi ở đây dùng 8 dãy thí nghiệm.
Kĩ thuật thông thường chỉ dùng 6 – 8 độ pha loãng khác nhau của chất thử, còn ở đây có thể dùng đến 11 độ pha loãng.
Kĩ thuật thông thường đọc kết quả bằng mắt thường (có thể đo them chỉ thị TTC), nhưng ở đây được xác định bằng cách mật độ quang học ở bước sóng 492 nm của dàn máy ELISA.
Phải có dàn máy ELISA. Trong dàn máy ELISA đã có một số dụng cụ nên không cần phải có một số thứ như các ống nghiệm dùng cho hệ pha loãng, vì ở đây đã có khay 96 giếng; có máy ủ nên không cần phải có tủ ấm…
6.2. Chuẩn bị
- Chuẩn bị mẫu thử: dung dịch gốc H 10 mg/ml (nếu phán đoán thuốc có tác dụng yếu thì pha dung dịch gốc 20 mg/ml).
- Chuẩn bị canh khuẩn gốc.
- Chuẩn bị môi trường lỏng dinh dưỡng M. Cần khoảng 40 ml.
- Chuẩn bị môi trường lỏng có vi khuẩn Mv. Cần khoảng 4 ml. Mỗi ml môi trường Mv có 500.000 tế bào vi khuẩn. Tùy trường hợp, có khi phải dùng đến 1 triệu tế bào vi khuẩn trong 1 ml hoặc hơn.
6.3. Tiến hành
Lấy khay 96 giếng (12 x 8) ở dàn máy ELISA, ta thấy có 8 dãy và 12 hàng. Ở 8 giếng của hàng 1, lấy micropipet 8 răng hút lấy ở mỗi răng 270 µl môi trường lỏng M cho vào mỗi giếng.
Cũng dùng micropipet 8 răng nhưng chỉ hút mỗi răng 150 µl môi trường M cho vào tất cả 88 giếng còn lại.
Sau đó, lấy micropipet 8 răng hút mỗi răng 30 µl dung dịch mẫu thử gốc của H (ví dụ 10 mg/ml) cho vào trong mỗi giếng của hàng 1 đã có sẵn 270 µl môi trường M. Trộn đều bằng cách lấy micropipet hút vào rồi lại đẩy ra vài lần. Như vậy, nồng độ của H trong các giếng của hàng 1 là 1 mg/ml.
Lấy micropipet 8 răng hút 150 µl ở mỗi giếng của hàng 1 chuyển sang hàng 2. Trộn đều như trên. Như vậy, nồng độ của H trong 8 giếng ở hàng 2 là 500 µg/ml. Tiếp tục làm như vậy cho đến hàng 11. Trộn đều. Dùng micropipet 8 răng hút ở mỗi giếng hàng 11 là 150 µl rồi bỏ đi. Như vậy, ta có 8 dãy và 12 hàng giếng, mỗi giếng đều có 150 µl.
Hàng Nồng độ của H (µg/ml)
1 1000
2 500
4 1255 63 5 63 6 32 7 16 8 8 9 4 10 2 11 1
12 Các giếng làm chứng, không có thuốc H
Thên vào tất cả 96 giếng, mỗi giếng 20 µl môi trường dinh dưỡng có vi khuẩn Mv
(105 cfu trong 1 ml). Cho khay ELISA vào máy ủ - lắc model: IEMS Incubator; hãng Thermo – Lab – Systems, Phần Lan. Trước hết, cài đặt nhiệt độ ủ ở 37 °C, thời gian ủ là 24 giờ, cứ mỗi giờ lắc 30 giây. Sauk hi đã cài đặt xong, ấn nút Start để bắt đầu.
6.4. Đọc kết quả
Đọc trên máy đọc ELISA tự động model: Multiskan Ascent, hãng Thermo – Lab – Systems, Phần Lan, dựa vào mật độ quang học ở 492 nm, sẽ xác định được MIC của H. Ví dụ xác định được MIC của H trên S. aureus là 43 µg/ml, là MIC trung bình của 8 dãy.
6.5. Kết luận
Đã nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn của chất H được chiết từ dược liệu A dùng kĩ thuật vi định lượng trong môi trường lỏng dùng máy ELISA của hãng Thermo – Lab – Systems, Phần Lan thấy MIC của H trên S. aureus là 43 µg/ml.