1.1 Về tính tan của chất thử nghiệm
Trong môi trường nuôi cấy vi nấm, pH tốt nhất cho sự phát triển của vi nấm là 5,5 - 6,0 chứ không phải pH trung tính. Vì thế khi hòa tan chất thử trong nước hoặc nước muối sinh lý, nếu chất thử khó tan, trước hết ta acid hóa đến pH 5,5 - 6,0 bằng acid HCl. Chỉ khi acid hóa mà chất thử vẫn không tan thì mới cần đến các dung môi đặc biệt như DMSO, DMF, PEG.
1.2 Chuẩn bị mẫu thử
Tương tự như trên, nếu chất thử khó tan, trước hết ta acid hóa đến pH 5,5 - 6,0 bằng acid HCl. Chỉ khi acid hóa mà chất thử vẫn không tan thì mới cần đến các dung môi đặc biệt như DMSO, DMF, PEG.
1.3. Môi trường
Môi trường nuôi cấy vi nấm khác với môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Có nhiều loại môi trường nuôi cấy vi nấm. Việc lựa chọn môi trường nào là tùy thuộc vào loại nấm thử và bản chất của chất thử. Có những trường hợp đòi hỏi môi trường rất phức tạp. sau đây là môi trường thông dụng nhất, dùng cho đa số các loại nấm.
* Môi trường lỏng Sabouraud
- Glucose 40g
- Casein pancreatic 5g
- Pepton 5g
- Nước vừa đủ 1000 ml
Đun đến sôi, vừa để hòa tan, vừa để tiệt trùng. Dùng NaOH hoặc HCl để điều chỉnh pH, sao cho pH sau tiệt trùng là 5,6 ± 0,2.
* Môi trường thạch Sabouraud
Thành phần cũng như trên, nhưng them thạch 15g. Đun đến sôi vừa để hòa tan, vừa để tiệt trùng. Dùng NaOH H hoặc HCl N để điều chỉnh pH, sao cho sau tiệt trùng pH là 5,6 ± 0,2.
1.4. Chuẩn bị chủng vi nấm để thử
Từ ống chủng gốc, cấy vi nấm trên mặt thạch dinh dưỡng. Để ủ nhiệt độ 28 oC cho nấm phát triển. Đối với nấm là bào tử chồi (blastospore), thường phải ủ 48 giờ; còn đối với sợi nấm (mycelia fungi), loại bào tử đính (conidiospore) thì phải ủ 4 - 5 ngày. Lấy các bào tử trên mặt thạch, nghiền trong nước muối sinh lý cho đồng nhất, rồi cho vào ống nghiệm đo độ đục. Thếm nước muối sinh lý để được hỗn dịch bào tử nấm, mà mỗi ml có một lượng nhất định c.f.u dựa vào đo độ đục so với một ống mẫu (ví dụ 500.000 cfu). Hỗn dịch nấm đã được chuẩn hóa số lượng cfu trong 1 ml gọi là canh nấm gốc.
Các vi nấm cần thử, tùy theo yêu cầu của chất thử và điều kiện thử. Theo một tài liệu của Ấn Độ, người ta dùng 5 loại vi nấm sau:
- Candida albicans
- Cryptococcus neoformans - Aspergillus fumigates
- Trichophyton mentagrophytes - Epidermophyton floccosum
1.5. Nhiệt độ ủ và thời gian ủ
Phải đảm bảo nhiệt độ ủ theo đúng yêu cầu của từng loại nấm. Trong đa số trường hợp, thường ủ ở nhiệt độ 28 ± 1oC . Về thời gian ủ, nếu là bào tử chồi thì ủ trong 24 - 48 giờ, còn sợi nấm thì thời gian ủ từ 72 - 96 giờ.