C. Các phương pháp xác định tác dụng chống oxi hóa
1.Phương pháp xác định hàm lượng MDA
Có nhiều phương pháp được dùng trong nghiên cứu quá trình peroxy hóa lipit màng tế bào. Các phương pháp này dựa trên:
- Sự xác định các sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipit
- Sự nhận biết các gốc tự do trong chuỗi phản ứng như đo phát quang sinh học đánh giá các gốc LOO hình thành, đo lượng các dien liên hợp hình thành.
- Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của mô
Hai nhóm 1 và 2 đơn giản và dễ thực hiện hơn so với nhóm 3, đặc biệt là phương pháp xác định sản phẩm sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipit: malonyl dialdehyt (MDA), là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipit màng tế bào do đó được áp dụng rộng rãi trong thực tế.
Phương pháp sử dụng axit thiobarbituric thường được áp dụng để xác định hàm lượng MDA trong tổ chức tế bào, từ đó đánh giá khả năng chống oxi hóa in vitro hoặc in vivo của chất nghiên cứu thể hiện qua việc làm giảm hàm lượng MDA.
1.1. Nguyên tắc
MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipit, khi cho phản ứng với axit thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử axit thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Phản ứng thực hiện ở môi trường pH 2 – 3, nhiệt độ 90 – 100 °C trong vòng 10 – 15 phút.
Đo cường độ màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu.
1.2. Thực nghiệm
Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa in vitro
* Tiến hành
Tách não chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphate (pH = 7,4) theo tỉ lệ 1:10 ở nhiệt độ 0 – 5 °C. Lấy 1 ml dịch đồng thể, thêm vào 0,2 ml các nồng độ
mẫu thử + 0,8 ml đệm phosphate và ủ 37 °C trong 15 phút (tự oxi hóa) hoặc ủ 37 °C trong 5 phút với hệ Fenton (FeSO4 0,1 mM : H2O2 15 mM theo tỉ lệ 1 : 1). Kết thúc phản ứng bằng 1 ml axit tricloacetic 10 %, ly tâm lấy dịch trong cho phản ứng với 1 ml axit thiobarbituric 0,8 % ở 100 C trong 15 phút và đo màu ở λ = 532 nm.
* Tính toán kết quả
Hoạt tính chống oxi hóa (HTCO) được tính theo công thức: HTCO (%) = [(CMDA Chứng – CMDA Thử ) / CMDA Chứng] x 100
C: nồng độ MDA (nM/ml) được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA
* Xác định hàm lượng MDA trong tổ chức gan hay não
- Xác định hàm lượng MDA trong não
Tách não chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphate theo tỉ lệ 1 : 10 ở nhiệt độ 0 – 5 °C. Lấy 1 ml dịch đồng thể + 1 ml đệm phosphate và ủ ở 37 °C trong 15 phút. Sau đó, thêm vào 1 ml axit tricloaxetic 10 %, ly tâm lấy dịch trong cho phản ứng với 1 ml axit thiobarbituric 0,8 % ở 100 C trong 15 phút và đo màu ở λ = 532 nm.
- Xác định hàm lượng MDA trong gan
Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch KCl 1,15 % theo tỉ lệ 1 : 10 ở nhiệt độ 0 – 5 °C. Lấy 2 ml dịch đồng thể + 1 ml đệm Tris 25 mM và ủ ở 37 °C trong 60 phút. Sau đó, thêm vào 1 ml axit thiobarbituric 0,8 % ở 100 °C trong 15 phút và đo màu ở λ = 532 nm.
* Tính toán kết quả
Hàm lượng MDA (nM/ml) được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA.
Hàm lượng MDA (nM/g tổ chức) được tính theo công thức: X (nM/g tổ chức) = (C x V1 x V2 x 1000) : (v1 x v2 x m) Trong đó:
X: hàm lượng MDA (nM/g tổ chức)
C: hàm lượng MDA (nM/ml) được tính dựa trên phương trình đường chuẩn V1: tổng thể tích của dung dịch phản ứng (ml)
V2: tổng thể tích của dịch đồng thể (ml)
v1: thể tích dịch sau ly tâm sử dụng trong phản ứng màu với thuốc thử (ml) v2: thể tích dịch đồng thể trong hỗn hợp phản ứng (ml)
m: khối lượng tổ chức sử dụng
* Thiết lập đường chuẩn MDA
- MDA chuẩn 1 ml (ở các nồng độ từ 304,5 đến 6090 nM/ml) - TCA 10 % 1 ml
- TBA 0,8 % 1 ml
Hiện màu ở 100 C 15 phút. Đo quang ở λ = 532 nm