Khi đã xác định được dịch chiết toàn phần của một dược liệu A có tác dụng kháng khuẩn trên một loại vi khuẩn V nào đó. Muốn xác định xem thành phần nào trong dược liệu A có tác dụng thì có thể phân lập ra một dạng chiết khác nhau rồi đem thử với vi khuẩn V đó, ta sẽ biết được thành phần nào không có tác dụng, thành phần nào có tác dụng và mức độ tác dụng. Nhưng để thăm dò nhanh hơn, ta có thể dùng phương pháp sinh tự kí.
7.1. Dụng cụ
- Tấm kính 10 x 25 cm có tráng sẵn lớp mỏng silicagel. Nếu không, phải có tấm kính và silicagel để tự tráng.
- Tủ sấy - Tủ ấm - Đèn tử ngoại - Hệ sắc kí - Micropipet, ống hút - Bút viết trên kính 7.2. Chuẩn bị - Chuẩn bị tấm kính có lớp mỏng silicagel
- Chuẩn bị hệ dung môi để sắc kí. Ví dụ, hệ dung môi toluene: acetone : ethylacetat : acid formic (5:2:2:1)
- Chuẩn bị canh khuẩn gốc, chuẩn bị môi trường thạch dinh dưỡng M và môi trường thạch dinh dưỡng có vi khuẩn Mv. Môi trường thạch dinh dưỡng có vi khuẩn Mv ở đây nên pha chế để 1 ml môi trường có 500.000 đến 3,5 triệu tế bào vi khuẩn (cfu) tùy theo trường hợp.
7.3. Tiến hành
Dùng tấm kính 10 x 25 cm có tráng sẵn lớp mỏng silicagel. Hoạt hóa tấm kính ở tủ sấy 125 °C trong 30 phút hoặc 105 °C trong 1 giờ. Chấm dịch chiết của A trên tấm kính, rồi sắc kí trên hệ dung môi đã chuẩn bị. Sau khi sắc kí xong, để bay hết dung môi ở nhiệt độ trong phòng. Nếu không đuổi hết dung môi có thể gây ra hiện tượng dương tính giả sau này.
Trên bản sắc kí, sẽ được các vết chất ở các vị trí khác nhau tùy theo tính chất của các chất có trong dịch chiết. Để phát hiện các chất rõ hơn, soi bản mỏng dưới đèn tử ngoại ở bước song 254 nm hoặc 366 nm. Đánh dấu các vết trên bản mỏng, thường đánh số vết ở mặt sau lớp mỏng ở mép tấm kính chiếu tương ứng với các vết.
Dùng ống hút hút môi trường thạch có vi khuẩn Mv và láng đều trên lớp…
7.4. Đọc kết quả
Sau khi ủ được 18 – 24 giờ, lấy tấm kính ra, đọc kết quả. Vùng vết chất nào trên bản mỏng, vi khuẩn không mọc được thì chất đó có tác dụng kháng khuẩn. Để phát hiện vi khuẩn mọc được dễ dàng hơn, dùng chỉ thị màu TTC (Triphenyl Tetrazolium
Chloride). Vùng có màu đỏ là vùng có vi khuẩn phát triển. Vùng vết chất nào đã đánh dấu trên tấm kính mà không bắt màu thì chất đó có tác dụng kháng khuẩn.
7.5. Kết luận
Từ kết quả thu được, ta rút ra kết luận chất nào có tác dụng, chất nào không có tác dụng .