C. Các phương pháp xác định tác dụng chống oxi hóa
2.Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa in vitro
2.1 Phương pháp sử dụng DPPH [1]
* Nguyên tắc
1,1 – diohenyl-2-picryhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng λ = 517 nm.
* Tiến hành
- Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1mM trong methanol (MeOH). Dung dịch này không bền với ánh sáng, chỉ pha trước khi dùng.
- Dung dịch thử: Lấy mẫu pha trong MeOH theo bảng 1: Bảng 1: Hỗn hợp phản ứng
Ống Dung dịch thử (ml) MeOH (ml) Dung dịch DPPH (ml)
Trắng 0 4 0
Chứng 0 3,5 0,5
Thử 0,5 3 0,5
Lắc đều các ống trong 15 giây, để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và đo quang ở bước sóng λ = 517 nm.
Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) được tính theo công thức: HTCO (%) = [ODchứng - ODthử)/ODchứng - ODtrắng] x 100
OD: Mật độ quang
2.2. Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II(Iron chelating activity) [7] (Iron chelating activity) [7]
* Nguyên tắc
Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Đánh giá khả năng phòng ngừa sinh ra các gốc tự do của chất nghiên cứu thể hiện qua sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không thể cho tồn tại ở trạng thái tự do, sẽ làm mất khả năng xúc tác gốc. Hoạt tính chống oxy hóa được thể hiện qua việc ngăn chặn sự tạo thành phức chất có màu giữa ion sắt II với 2,2’-bipyridyl (thuốc thử ferrozine, đặc hiệu với ion sắt II).
* Tiến hành
- Pha các dung dịch FeSO4.7H2O 100 mM, Ferrozine 300 µM, NaCl 0,15 M trong nước cất. - Pha hỗn hợp phản ứng theo bảng 2: Bảng 2: Hỗn hợp phản ứng Ống FeSO4 100 mM (ml) Ferrozine 300 µM (ml) Mẫu thử (ml) NaCl 0,15 M (ml) Trắng 0,3 0 0,3 2,4 Chứng 0,3 0,3 0 2,4 Thử 0,3 0,3 0,3 2,1
Lắc đều các ống trong 15 giây, để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và đo quang ở bước sóng λ = 562 nm. EDTA được sử dụng như chất đối chiếu dương tính (positive control).
Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) được tính theo công thức: HTCO (%) = [ODchứng - ODthử)/ODchứng - ODtrắng] x 100 OD: Mật độ quang
2.3. Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt gôc superoxyd O(Superoxide scavenging) [8] (Superoxide scavenging) [8]
Đánh giá khả năng phòng vệ loại bỏ các gốc tự do đã sinh ra của chất nghiên cứu qua việc ngăn chặn sự tạo thành gốc superoxyd O. Gốc superoxyd được tạo thành trong phản ứng giữa xanthin và xanthin oxydase sẽ được định lượng bằng phương pháp khử sử dụng nitroblue tetrazolium (NBT) cho phức chất có màu tím được đo quang ở bước sóng λ = 550 nm. Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm sự hình thành phức màu tím.
* Tiến hành
Sử dụng đĩa 96 ô (200 µl/lô), trong mỗi ô mẫu thử thêm vào theo trình tự như sau: - 50 µl dung dịch xanthin 4 mM
- 50 µl thuốc thử NBT 225 µM
- 50 µl đệm phosphate (pH 7,8 có thêm EDTA 1 mM) - 10 µl mẫu thử ở các nồng độ khác nhau.
- 40 µl xanthin oxydase hoạt độ 1 đơn vị/mg
Để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 3 phút và đo quang ở bước sóng λ = 550 nm. Tiến hành thực hiện song song với ô chứng (thay 10 µl mẫu thử bằng 10 µl đệm phosphat) và ô trắng (không có thuốc thử NBT, thay bằng 50 µl đệm phosphat).
Enzyme superoxyd dismutase (SOD) được tính theo công thức: HTCO (%) = [ODchứng - ODthử)/ODchứng - ODtrắng] x 100
OD: Mật độ quang
2.4. Phương pháp đánh giá khả năng đánh bắt peroxyhydro H2O2(Hydrogen peroxide scavenging activity) [2] (Hydrogen peroxide scavenging activity) [2]
* Nguyên tắc
Hai tiểu phân O và H2O2 sinh ra từ các chuyển hóa trong cơ thể với nồng độ vô cùng thấp, dễ dàng bị loại bỏ và không độc hại cho cơ thể nhưng nếu hiện diện ở nồng độ cao (do stress oxy hóa) chúng có thể tạo ra 1O2, OH là những phân tử và gốc có khả năng phản ứng rất cao, dễ dàng phản ứng với các chất hữu cơ tạo ra các peroxyd và từ đó tạo ra nhiều sản phẩm độc hại cho tế bào. Hoạt tính chống oxy hóa và mẫu thử được thể hiện qua việc làm giảm lượng H2O2 đưa đến làm giảm phản ứng màu giữa H2O2 và đỏ phenol
(màu của đỏ phenol sẽ chuyển sang màu tím sau phản ứng với H2O2 trong sự hiện diện của enzyme peroxydase từ cải gia vị (horseradish)
* Tiến hành
Tiến hành hỗn hợp phản ứng ở các ống thử theo trình tự sau: - 20 µl mẫu thử ở các nồng độ khác nhau
- 20 µl H2O2 10 mM.
- 1,8 ml đệm phosphate (pH 7 có thêm NaCl 28 mM và dextrose 5,5 nM). Lắc đều các ống và để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
- 0,2 dung dịch đỏ phenol 0,1 % pha trong NaOH 1M. - 20 µl enzyme hoseradish peroxydase hoạt độ 5 mg/ml.
Lắc đều các ống và để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. - 20 µl NaOH 1N để ngừng phản ứng
Đo quang ở bước sóng λ = 610 nm. Tiến hành thực hiện song song với ô chứng (thay 20 µl (mẫu thử bằng 20 µl đệm phosphat) và ô trắng (không có thuốc thử đỏ phenol, thay bằng 0,2 ml đệm phosphat).
Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) được tính theo công thức: HTCO (%) = [ODchứng - ODthử)/ODchứng - ODtrắng] x 100 OD: Mật độ quang
2.5. Phương pháp xác định hoạt tính peroxydaza máu người theo phương phápE.Xavron E.Xavron
* Vài nét về Enzym Peroxydaza trong máu
Peroxydaza thuộc nhóm oxydo - reductaza, nó xúc tác cho các phản ứng oxy hóa khử các hợp chất hữu cơ khi có sự tham gia của H2O2. Peroxydaza phổ biến rộng rãi trong thực vật, vi sinh vật và động vật. Ở động vật peroxydaza có nhiều trong bạch cầu, trong sữa, tuyến giáp trạng và mô máu.
Peroxydaza là enzym hai cấu tử hem - protein. Nhóm ngoại của enzym này hoàn toàn giống với Fe – pocphyrin (hemin.đỏ) của hemoglobin và catalaza. Fe trong peroxydaza có hóa trị 3. Trong peroxydaza, nguyên tử Fe của vòng pocphyrin liên kết với
protein nhờ 2 loại liên kết este giữa nhóm cacboxyl và nhóm hydroxyl của tyrozin và liên kết muối giữa ion Fe3+ với nhóm cacboxyl của protein.
Ảnh hưởng của pH lên hoạt động của peroxydaza thể hiện sự bền vững của các liên kết giữa nhóm ngoại với protein - enzym trong các nồng độ khác nhau. Trong khoảng pH = 5-7 hoạt động của các enzym ít thay đổi, ngoài khoảng đó enzym không hoạt động. Trong máu người, bạch cầu hạt chứa phần lớn enzym peroxydaza trong máu. Enzym này nằm trong bạch cầu trung tính là bạch cầu có ý nghĩa nhất đối với quá trình bảo vệ cơ thể.
Theo Theonell và Chane, peroxydaza phản ứng theo cơ chế sau: