- Chuột nhắt trắng 1820 g ,4 6 tuần tuổi.
4. Mô hình gây nhiễm nấm giác mạc ở thỏ
Rất nhiều loại nấm có thể gây nhiễm nấm giác mạc ở thỏ. Các tác giả Ấn Độ đã gây được nhiễm nấm ở giác mạc thỏ bằng 15 loại nấm khác nhau. Sau đây, xin nêu mô hình gây nhiễm nấm ở giác mạc thỏ bằng C.albicans. Đối với nhiều loại nấm khác cũng có thể gây được nhiễm nấm ở giác mạc thỏ theo cách tương tự.
4.1. Dụng cụ
- Chủng nấm Candida albican
- Thỏ 2,0 – 2,5 kg - Ống nhỏ giọt - Ống hút
- Môi trường thạch Sabouraud - Hộp Petri
- Cối chày sứ - Tủ ấm - Tủ sấy
- Que bạch kim để cấy nấm
- Đèn cồn để tiệt trùng que bạch kim - Dao mổ
- Cân
- Thuốc nghiên cứu
- Dung dịch xylocain 4%
- Dung dịch hydrocortison 2,5% - Bơm kim tiêm
- Kính lúp
4.2. Chuẩn bị
- Chuẩn bị môi trường thạch Sabouraud, xem mục 1.3 của chương “ Nghiên cứu tác dụng chống vi nấm in vitro”.
- Chuẩn vị canh nấm gốc Candida albicans: Từ ống chủng gốc C.alibicans, cấy nấm trên mặt thạch Sabouraud (dùng thạch nghiêng trong ống nghiệm hoặc hộp Petri). Để ủ ở nhiết độ 28oC trong 48 – 72 giờ cho nấm phát triển. Lấy các bào tử trên thạch, cho vào cối sứ, nghiền trong nước muối sinh lý cho đồng nhất, rồi cho vào ống đo độ đục. Thêm nước muối sinh lý để được hỗn dịch bào tử nấm mà mỗi ml có 500 000 cfu dựa vào độ đục so với một ống mẫu. Dịch này gọi là canh nấm gốc.
4.3. Gây mô hình
- Nhỏ hydrocortison 2,5 % vào cả 2 mắt thỏ, mỗi mắt một giọt, một lần từ ngày hôm trước và một lần vào ngày gây nhiễm vi nấm. Mục đích là gây ức chế miễn dịch để thỏ dễ bị vi nhiễm nấm hơn.
- Vào ngày gây nhiễm nấm, sau khi nhỏ hydrocortison được một giờ, gây tê vào mắt thỏ bằng cách nhỏ vào mỗi mắt thỏ một giọt dung dịch xylocain 4%
- Sau khi mắt thỏ đã tê, tiêm 0,1 ml canh nấm gốc vào giác mạc của cả 2 mắt thỏ. Giác mạc thỏ sẽ bị nhiễm vi nấm sau 48 – 72 giờ và tiếp tục phát triển sau đó.
- Mức độ nhiễm vi nấm được đánh giá bằng mắt thường và bằng kính lúp vào ngày thứ tư, bằng cách cho điểm từ 1 đến 4.
4.4. Thử thuôc
- Khi đã chỉnh lý mô hình có kết quả (tức là giác mạc có bị nhiễm nấm), thì có thể thử thuốc. Thường dùng dạng thuốc nước nhỏ mắt.
- Để thử thuốc, thường dùng 20 thỏ: 10 thỏ, mỗi thỏ dành 1 mắt để đối chứng và một mắt để thử thuốc tham chiếu; còn 10 thỏ, mỗi thỏ dùng một mắt để đối chứng và một mắt để dùng thuốc nghiên cứu.
- Cách tiến hành lúc đầu như phần gây mô hình. Thuốc được nhỏ từ ngày thứ 3 sau khi gây nhiễm vi nấm, ngày nhỏ 2 lần, sáng vào chiều, liền trong 14 ngày.
4.5. Đánh giá kết quả
Đánh giá kết quả bằng mắt thường và bằng kính lúp vào 2 thời điểm: lúc 7 ngày và lúc 14 ngày kể từ khi dùng thuốc dựa vào số mắt khỏi nấm và dựa vào mức độ còn nhiễm vi nấm theo thang điểm từ 1 đến 4.