¾ Phương pháp dùng chỉ thị phân tử DNA:
Nhằm đánh giá mức độ sai khác về mặt di truyền ở cấp độ phân tử DNA của các mẫu vi khuẩn và phân loại các chủng.
Tháng 3 năm 1997, J.Yashitola, D. Krishnaveni, A.P.K.Reddy và R.V.Sonti đã thu thập 67 isolate từ năm 1994 đến 1995 trên 18 vùng của Ấn Độ. Sử dụng phương pháp DNA (RFLP) với hai mẫu dò (probe) là các trình tự lặp lại riêng biệt:
- 21 -
Probe dựa vào trình tự yếu tố chèn IS1112
Kết quả, với Probe avrXa10 từ 67 Isolate tác giảđã phân ra 9 kiểu sai khác phân tử
dựa vào enzyme cắt giới hạn BamHI. Probe IS 1112 phân ra 11 kiểu sai khác phân tử dựa vào enzyme cắt giới hạn EcoRI. Cuối cùng, các tác giả tổng hợp cả hai Probe avrXa10 và Probe IS 1112 thu được 15 kiểu sai khác phân tử.
Năm 1999, Tika B.Adhikari, T.W.Mew, và Jan E. Leach sử dụng 2 phương pháp rep- PCR và IS-PCR để tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền đối với 171 isolate - phân lập được
ở 8 vùng sinh thái khác nhau tại Nepal. Trong đó tác giả sử dụng 3 mồi ERIC1R, ERIC2 (trong cùng một phản ứng) cho rep-PCR và mồi J3 cho IS-PCR. Mồi ERIC1R và ERIC2 được thiết kế trên cơ sở những các chuỗi lặp bảo thủ vùng liên gen (enterobacterial repetitive intergenic consensus) có kích thước 124 - 127 bp. Còn mồi J3 được thiết kế trên cơ sở hai
đoạn chèn ở trình tự IS1112, IS1113. Kết quả phân lập được 31 haplotype (kiểu sai khác phân tử) từ 171 isolate nghiên cứu. Sử dụng 3 mồi REP là: ERIC 1RF 5’ - ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC - 3’ ERIC 2F 5’ - AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG - 3’ BOXA 1RF 5’- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG - 3’ Và một mồi IS: J3F 5’ - GCTCAGGTCAGGTCGCCTGG - 3’
Tiếp nối thành công của Tika B.Adhikari (1999), tháng 6 năm 2007, Jiajian và cộng sự đã sử dụng phương pháp IS-PCR với mồi J3 trên 7 chủng vi khuẩn Xoo tồn tại tại Trung Quốc. Khi so sánh với DNA ladder và so sánh với trình tự genome của 2 chủng KACC10331 (Hàn Quốc) và MAFF311018 (Nhật Bản), các tác giảđã phát hiện ra 3 locus mới trên trình tự
(A) IS1112d GATATCGATATGGGT GGCGAATT…//…AAGCCGCC GGTGGATTCTTCCGGCG GATATCGATATGGGT GGATTCTTCCGGCG 405 (B) IS1112a TGAGCCAGTGTTTTG GGCGGCTT…//…AATTCGCC ACAGAAAACGCGGGT TGAGCCAGTGTTTTG ACAGAAAACGCGGGT (C) IS1112b GCTTCAACCGCCGATTCGACC GGCGGCTTCAACTCTGGAT…… GCTTCAACCGCCGATTCGACCTGAAACAGATGCTGCCGCG…… ISXo2 957
Hình 2.9: Ba trình tự locus mới trên trình tự chèn IS1112 phát hiện tại Trung Quốc (2007)
Tại Pakistan Shazia Mannan (2007) cũng tiến hành phương pháp tương tựđã phân 105 isolate thành thành 2 nhóm (A, B) bằng chỉ thị IS - PCR (IS 1113) sử dụng mồi J1 [5’- CGAGTCCAGTCCAGCGAGCC - 3’]. Bằng chỉ thị REP - PCR cho thấy mức độđa hình rất cao, phân chúng thành 7 nhóm chủng khác nhau (group 1 đến group 7).
Trong một nghiên cứu khác T. B. Adhikari năm 1994 đã nghiên cứu chi tiết về đa dạng di truyền chủng bệnh bạc lá tại khu vực Châu Á. Tiến hành trên 308 isolate, trong đó có 76 isolate tại Trung Quốc, 17 isolate tại Malaixia 45 isolate tại Nepal, 17 chủng tại Ấn Độ, 24 isolate tại Hàn Quốc, 34 isolate tại Indonexia, và 95 isolate tại Philippine. Tiến hành nghiên cứu dựa trên các trình tự chèn IS1112 và vùng avrXa10. Dùng các mẫu dò pJEL101 plasmid pUC18 với vùng cắt giới hạn 2.4 kb của EcoRI - Him III để nhận dạng trình tự chèn IS1112. Dùng mẫu dò pBSavrXa10 mang vùng cắt giới hạn HimIII (3.1kb) lấy ra từ plasmid pBLuscripII. Kết quả phân thành 5 nhóm chủng với khoảng biến động di truyền của các nhóm nằm trong khoảng 0.16 đến 0.51 và sự khác nhau giữa các nhóm là 0.48 đến 0.64.
Năm 2001, V.S. Gupta và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu trên 16 isolate tại Ấn Độ
- 23 -
POA-4, POA-10, POA-11, OPK-7, OPK-17) và phương pháp IS1112 - PCR dùng 2 mồi
PJEL1 và PJEL2 để đánh giá đa dạng di truyền và xác định các chủng vi khuẩn. Kết quảđã phân loại thành 5 nhóm chủng ở mức tương đồng 0.57.
Năm 2007 tại Sri Lanka, công trình nghiên cứu của K.K.S. Penando đã sử dụng phương pháp RAPD - PCR dùng các đoạn mồi ngẫu nhiên (OPD7, OPD20 và OPK) để phân tích đa dạng di truyền của 7 nhóm isolate. Kết quả phân chúng thành 6 nhóm tại mức tương
đồng 0.6.
¾ Phương pháp phân tích isozyme:
Phương pháp phân tích isozyme là phương pháp phân tích các trạng thái khác nhau của một enzyme. Xét về mặt di truyền, thì sự sản sinh các isozyme có thể do hiện tượng lặp
đoạn locus gen; đột biến gen tạo nên các alen khác nhau, diễn ra trên các locus khác nhau hoặc do các trạng thái alen khác nhau của một locus gen gây ra [16].
Tại Nigeria, A. Onasanya và cộng sự đã sử dụng phương pháp phân tích isozyme
để nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng bệnh bạc lá thu thập tại các khu vực khác nhau ở Tây Phi.
Năm 2007 đã tiến hành nghiên cứu, sử dụng phương pháp SDS-PAGE dùng marker enzyme glucose-6 phosphat hydrogenase để nghiên cứu đa hình trên 30 isolate. Kết quảđã phân ra thành 2 nhóm A (46%) và B (54%) ở mức tương đồng 0.55.
Năm 2008 các ông đã sử dụng 23 chỉ thị enzyme để tiếp tục nghiên cứu trên 30 isolate
đã nghiên cứu, kết quả cũng đã phân chúng thành 2 nhóm Xoo-A và Xoo-B, tuy nhiên trong mỗi nhóm lại phân thành 2 nhóm nhỏ là Xoo-A1 (30%), Xoo-A2 (20%) và Xoo-B1 (43%), Xoo-B2 (7%). Ngoài ra, dựa trên mối tương quan giữa các chỉ thị và các nhóm chủng, có thể
phân 23 chỉ thị isozyme trên thành 3 nhóm. Nhóm 1 nhận diện tốt với nhóm chủng Xoo-A1, nhóm 2 với chủng Xoo-2, nhóm 3 với các chủng Xoo-B1 và Xoo-B2.