* Gen kháng bạc lá Xa4
Theo Yoshimurra chỉ thị liên kết với gen Xa4 là chỉ thị STS MP1 và MP2 trên nhiễm sắc thể số 11. Theo Wang Wen Ming xác định Xa-4 nằm ở nhiễn sắc thể 11, và xác
định marker RFLP giữa G181 và M55, khoảng cách di truyền là 4,4cM và 3,8cM. Theo Sun xác định đánh dấu nằm ở giữa R1506 và S12886, khoảng cách di truyền đều là 0,5cM. Muốn chọn tạo giống chứa gen kháng Xa4 thì phải biết di truyền của gen này theo kiểu gì, theo quy luật nào để từ đó có phương pháp chọn lọc hữu hiệu. Để nghiên cứu di truyền của gen này chúng tôi tiến hành lai giữa dòng IR24 không chứa gen với giống N91 c hứa gen kháng Xa4, trồng F1 và tạo quần thể phân ly F2. Dùng chỉ thị MP1 điều tra trên 137 cá thể trong quần thể
phân li F2 giữa IR24 x 10707 thông qua PCR. Kết quảđã chọn được 33 cá thể dạng đồng hợp kháng Xa4 (RR), 66 cá thể chứa gen dị hợp tửXa4 (Rr) và 38 cá thể chứa gen dạng đồng hợp lặn Xa4 (rr). Song song với việc sử dụng chỉ thị phân tửđểđiều tra trạng thái của gen, chúng tôi tiến hành lây nhiễm nhân tạo chủng bệnh lá 2A mà gen Xa4 kháng được.Gen Xa4 là gen trội lên kiểu gen RR và Rr đều thể hiện tính kháng, kiểu gen rr bị nhiễm với chủng lây nhiễm, kết quả tổng hợp ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Xác định trạng thái gen Xa4 bằng chỉ thị phân tử và lây nhiễm nhân tạo chủng 2A
Điều tra kiểu gen của các thể
trong quần thể F2 bằng PCR Điều tra kinhân tểu hình bạo chủằng 2A ng lây nhiễm
Kiểu gen Số lượng Kháng Nhiễm
Độ chính xác (%) Xa4 (RR) 33 32 1 97,00 Xa4 (Rr) 66 63 3 95,45 Xa4 (rr) 38 2 36 94,73 Tổng 137
Như vậy bằng chỉ thị phân tử đã xác định được tỷ lệ phân ly gen kháng Xa4 trong quần thể phân ly F2 là 33(RR) : 66(Rr) : 38(Rr), tỷ lệ này tương đương với quy luật di truyền của Menden (1:2:1). Tương tựđối với lây nhiễm nhân tạo chúng tôi cũng thu được tỷ lệ phân li 32 (RR) : 63 (Rr) : 36 (rr) cũng tương đương với tỷ lệ (1: 2 : 1).
So sánh giữa 2 phương pháp chỉ thị phân tử DNA và phương pháp lây nhiễm truyền thống thấy rằng chỉ thị phân tử DNA có độ chính xác cao, trên 90%. Chỉ thị trên hoàn toàn có thể sử dụng trong việc chọn lọc giống lúa chứa gen kháng Xa4.
Hình 3.12 a. Điện di sản phẩm PCR gen Xa4 các cây Bố, Mẹ, F1 và quẩn thể F2 tổ
hợp lai (IR24 x N91)
Hình 3.12b. Ảnh lây nhiễm nhân tạo gen Xa4 trên quần thể F2 chủng 2A
* Gen kháng Xa7
Gen kháng Xa7 là một gen trội, gen này theo nghiên cứu của chúng tôi thì gen này kháng được hầu hết các chủng bệnh bạc lá miền Bắc Việt Nam. Theo Taura và cộng sự gen
Xa7 liên kết với chỉ thị STS P3 và nằm trên nhiễm sắc thể số 6, với khoảng cách là 0,0 cM.
Để nghiên cứu di truyền gen kháng này, tương tự như gen Xa4 chúng tôi tiến hành lai dòng 10110 chứa gen kháng Xa7 với dòng IR24 không chứa gen này. Trồng F1 và tạo quần thể
phân ly F2, trên quần thể phân ly F2 tiến hành phân tích di truyền bằng chỉ thị phân tử, sau đó kiểm tra độ chính xác bằng lây nhiễm nhân tạo. 160 cá thểđã được đánh dấu và phân tích di truyền. Bằng chỉ thị phân tử DNA xác đinh được 41 cá thể chứa gen Xa7 dạng đồng hợp trội (RR), 47 cá thể chứa gen Xa7 dạng đồng hợp lặn (rr) và 72 cá thể chứa gen Xa7 dạng di hợp (Rr) tương đương với tỷ lệ phân ly 1: 2 : 1.
Bảng 3.11. Kết quả xác định trạng thái gen Xa7 bằng chỉ thị phân tử và lây nhiễm nhân tạo chủng 2A
Điều tra kiểu gen của các thể trong quần thể phân ly F2 bằng
PCR
Điều tra kiểu hình bằng lây nhiễm nhân tạo chủng 2A
Kiểu gen Số lượng Kháng Nhiễm
Độ chính xác (%) Xa7 (RR) 41 41 0 100 Xa7(Rr) 72 70 2 97,2 Xa7 (rr) 47 3 44 93,6 Tổng 160 IR24 BB4 F1 Q uần thể phân ly F2 rr RR Rr RR RR RR RR rr Rr Rr Rr rr Rr Rr rr RR RR Rr rr rr Rr RR IR24
- 69 -
Bằng lây nhiễm nhân tạo kiểm chứng lại những cá thểđã xác định bằng chỉ thị phân tử chúng tôi cũng đã chọn được 41 cá thể chứa gen kháng Xa7 dạng đồng hợp trội (RR), 70 cá thể chứa gen di hợp (Rr) và 44 cá thể chứa gen Xa7 đồng hợp lặn cũng tương đương với tỷ lệ
phân ly theo kiểu Menden 1: 2: 1. So sánh giữa 2 phương pháp thấy rằng sử dụng chỉ thị
phân tửđể xác định gen kháng Xa7 dạng đồng hợp tử trội đạt độ chính xác 100%, chọn dạng dị hợp đạt chính xác 97,2% và dạng đồng hợp lặn 93,6%.
Hình 3.13 a. Điện di sản phẩm PCR gen Xa7 các cây Bố, Mẹ, F1 và quẩn thể F2 tổ
hợp lai (IR24 x 10110)
Hình 3.13 b. ảnh lây nhiễm nhân tạo gen Xa7 trên quần thể F2 bằng chủng 2A
* Gen kháng Xa21 và xa5
Hai gen này là 2 gen kháng rất tốt đối các chủng bệnh bạc lá Miền Bắc Việt Nam, trong đó gen Xa21 là gen trội còn gen xa5 là gen lặn. Một trong những ưu điểm trong chọn tạo giống lúa thuần là tính kháng chỉ thể hiện khi tất cả các gen ở trạng thái đồng hợp lặn lên khi lây nhiễm nhân tạo tìm ra dạng kháng thì chắc chắn nó chứa gen dồng hợp tử lặn. Còn đối với gen trội bằng lây nhiễm nhân tạo thì cả dạng Rr và RR đều thể hiện tính kháng nên rất dễ
nhầm lẫn giữa hai dạng trên. Nhiều nghiên cứu sử dụng di truyền bằng chỉ thị phân tử DNA
đối với gen Xa21, chúng tôi sử dụng chỉ thị STS pTA818 và pTA248 nằm trên nhiễm sắc thể
số 11, còn đối với gen xa5 chúng tôi sử dụng chỉ thị STS RG556 sau đó sử dụng enzyme cắt giới hạn DraI để cắt sản phẩm PCR, sau đó điện di và xác định đa hình.
- Gen Xa21: Điều tra 130 cá thể trong quần thể phân ly F2 của tổ hợp (IR24xIRBB21) bằng chỉ chỉ thị pTA818 và pTA248 thông qua kỹ thuật PCR, chúng tôi chọn
được 34 cá thể chứa gen Xa21 dạng (RR), 37 cá thể dạng Xa21(rr) và 59 cá thể dạng
Xa21(Rr) tương đương với tỷ lệ 1:2:1. Kiểm chứng độ chính xác bằng lây nhiễm nhân tạo chúng tôi thấy, kết quả tương tự tỉ lệ phân ly 32(RR) : 59 (Rr) : 35(rr) tương đương với tỷ lệ rr RR rr Rr rr Rr Rr rr rr Rr rr Rr Rr
IR24 BB7 F1 Quần thể phân ly F2
1:2:1, (bảng 3.11). Như vậy nếu sử dụng chỉ thị phân tử để chọn lọc gen kháng Xa21 dạng
đồng hợp trội sẽ có độ chính xác 96,7%, đồng hợp lặn 95,9% và dị hợp là 100%.
- Gen xa5: Tương tự gen Xa21, chúng tôi cũng điều tra 140 cá thể trong quần thể
phân ly F2 (IR24 x 10668) bằng chỉ thị RG556 thu được 36 cá thểxa5(rr), 33cá thểxa5 (RR) và 60 cá thể xa5(Rr) tương đương với tỷ lệ phân ly 1 : 2 : 1. Kiểm chứng độ chính xác bằng lây nhiễm nhân tạo chủng 4 thấy rằng tỷ lê 36 rr : 57 Rr : 31 RR tương ứng với tỷ lệ phân ly theo Menden 1:2:1. Sử dụng chỉ thị phân tử chọn lọc gen kháng xa5 đồng hợp lặn có độ chính xác 100%, gen dị hợp 95,4% và gen đồng hợp trội 96,3%.
Bảng 3.12. Kết quả xác định trạng thái gen xa5 và Xa21 bằng chỉ thị phân tử và lây nhiễm nhân tạo chủng 4
Điều tra kiểu gen của các thể trong quần thể F2 bằng PCR
Điều tra kiểu hình bằng lây nhiễm nhân tạo chủng số 4
Kiểu gen Số lượng Kháng Nhiễm
Độ chính xác (%) Xa21 (RR) 34 32 2 96,7 Xa21(Rr) 59 59 0 100,0 Xa21(rr) 37 2 35 95,9 xa5 (RR) 33 2 31 96,3 xa5(Rr) 60 3 57 95,4 xa5(rr) 36 36 0 100 Hình 3.14a. Điện di sản phẩm PCR gen Xa21 các cây Bố, Mẹ, F1 và quẩn thể F2 tổ
hợp lai (IR24 x IRBB21
Hình 3.14 b. ảnh lây nhiễm nhân tạo gen Xa21 trên quần thể F2 chủng 4
IR24 BB21 F1 Quần thể phân ly F2
- 71 -
Như vậy nghiên cứu di truyền tính kháng bệnh bạc lá của gen Xa4, xa5, Xa7 và Xa21
bằng chỉ thị phân tử DNA và bằng lây nhiễm nhân tạo của cây bố, mẹ, F1 và F2 thấy rằng các gen kháng bệnh bạc lá di truyền đơn gen theo kiểu Menden với tỷ lệ phân ly F2 là 1:2:1, điều này rất có ý nghĩa trong chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá mới.