chọn dòng thuần.
Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro bao phấn chứa tiểu bào tử
hoặc hạt phấn chưa chín trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo để tạo cây đơn bội. Kỹ thuật tạo cây đơn bội in vitro thông qua kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây đã cho phép nhanh chóng tạo ra hàng loạt cây đơn bội, từ đó lưỡng bội hóa bằng colchicine sẽ tạo được cây nhị lưỡng bội, được ứng dụng trong nghiên cứu di truyền và chọn tạo giống cây trồng. Trong đó cây đơn bội kép tái sinh từ hạt phấn F1 có ý nghĩa thực tiễn rất lớn. Đây là phương pháp tạo các dòng thuần đồng hợp tử tuyệt đối hoàn toàn không phân ly ở thế hệ sau, đảm bảo tính ổn định di truyền. Bằng chọn giống truyền thống thì ít nhất phải mất 7 – 8 đời tự thụ liên tục mới tạo được dòng thuần, nhưng bằng nuôi cấy bao phấn chỉ mất 8 - 12 tháng là có thể tạo ra dòng thuần hoàn chỉnh phục vụ nghiên cứu.
Để tạo ra những dòng lúa kháng bệnh bạc lá, năng suất cao, chất lượng tốt chúng tôi tiến hành nuôi cấy bao phấn của các tổ hợp lai F1 giữa các giống tốt với những giống chứa gen kháng bệnh bạc lá, đó là 6 tổ hợp: HT1/IRBB5, LT2/ IRBB7, BT7/ IRBB7, Xi23/IRBB5,
- 83 -
ĐB6/IRBB4, KD18/IRBB21. Đòng được lấy vào khoảng 9 giờ sáng, chọn đòng lúa to, khỏe từ thân chính và có khoảng cách giữa gối lá đòng và tai lá cuối cùng từ 3-5 cm. Rửa sạch đất bụi bẩn, tỉa bớt lá và cắt bỏ các phiến lá sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng và cồn 700. Các
đòng được bọc kín trong giấy báo rồi đặt trong túi polyethylen để khỏi bị khô rồi để trong tủ
lạnh 7 - 80C khoảng 6 - 7 ngày, sau đó bao phấn được tách ra và nuôi cấy và tiến hành các thí nghiệm.
* Ảnh hưởng của nền môi trường tới khả năng hình thành callus
Kiểu gen, môi trường và mối tương tác giữa kiểu gen và môi trường đều có ảnh hưởng
đến khả năng hình thành callus khi nuôi cấy bao phấn, trong đó môi trường đóng vai trò quyết
định, làm tăng hiệu quả nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy với thành phần cơ bản như các nguyên tố vi lượng, đa lượng, các vitamin, các chất điều hòa sinh trưởng…, có ảnh hưởng rất lớn tới hiệu quả nuôi cấy. Nhằm tìm được môi trường nuôi cấy thích hợp chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường đến khả năng hình thành callus trong nuôi cấy bao phấn lúa. 6 tổ hợp lai trên được nuôi cấy trên môi trường MS, N6, He5, mỗi môi trường đều bổ
sung 2mg/l 2,4D + 0.5mg/l Kinertin + 3%Sucrose. Kết quảđược trình bày trong bảng 3.20 Qua bảng 3.20 cho thấy, trên cả 3 loại môi trường chúng tôi tiến hành nghiên cứu các tổ hợp đều cho phản ứng tạo callus, riêng ĐB6/IRBB4 không cho phản ứng tạo callus trên môi trường MS, LT2/IRBB7 không cho phản ứng tạo callus trên môi trường He5. Tỷ lệ tạo callus trên các môi trường là khác nhau. Tỷ lệ tạo callus trên môi trường N6 trung bình của các tổ hợp đạt cao nhất (23,17%), trên môi trường MS tỷ lệ callus thu được thấp nhất (2,00%), trên môi trường He5 tỷ lệ tạo callus đạt 9,25%. Đối với cả 6 tổ hợp nghiên cứu, chúng đều cho phản ứng tạo callus cao nhất trên môi trường N6, tổ hợp ĐB6/IRBB4 cho tỷ lệ tạo callus cao nhất trên môi trường N6 là 41,25%.
Tỷ lệ bao phấn hóa nâu trong thí nghiệm khá cao trung bình 60,53%. Tỷ lệ bao phấn hóa nâu cao nhất trên môi trường He5 (63,17%), thấp nhất trên môi trường N6 (57,50%), trên môi trường MS tỷ lệ bao phấn hóa nâu là 60,92%.
Kết quả chúng tôi thu được trên cả ba môi trường nghiên cứu, nhận thấy trên môi trường N6 thì cả 6 tổ hợp đều cho phản ứng tạo callus, tỷ lệ bao phấn tạo callus thu được lớn nhất. Điều này chứng tỏ môi trường thích hợp nhất với giai đoạn tạo mô sẹo là môi trường N6 và thích hợp cho nhiều kiểu gen. Kết quả thu được phù hợp với kết quả nghiên cứu của Chu và cộng sự (1975), Chen (1983), Phan Hữu Tôn (2004).
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của nền môi trường tới khả năng hình thành callus Nền môi trường Tổ hợp Chỉ tiêu theo dõi MS N6 He5 TB (V) HN 67,08 58,33 69,17 64,86 HT1/IRBB5 TCL 1,25 5,00 0,83 2,36 HN 69,58 64,58 66,67 66,94 LT2/ IRBB7 TCL 1,25 5,00 0,00 2,08 HN 55,00 51,67 61,67 56,11 BT7/ IRBB7 TCL 4,58 27,08 11,67 14,44 HN 58,75 56,67 59,17 58,20 Xi23/IRBB5 TCL 2,92 37,50 13,33 17,92 HN 54,17 56,25 59,17 56,53 ĐB6/IRBB4 TCL 0,00 41,25 20,42 20,56 HN 61,90 56,70 64,12 60,51 KD18/IRBB21 TCL 2,50 23,65 8,95 11,45 HN 60,92 57,50 63,17 60,53 Trung bình (MT) TCL 2,00 23,17 9,25 11,47
Ghi chú HN: tỷ lệ bao phấn hóa nâu (%), TCL, tỷ lệ bao phấn tạo callus (%) TB (1MT): trung bình theo công thức, TB (V): trung bình theo tổ hợp
Hình a: Bao phấn hóa nâu Hình b: Callus mới hình thành Hình c: Callus phát triển Hình 3.19. Sự hình thành callus từ nuôi cấy bao phấn tổ hợp Xi23/IRBB5
* Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới sự hình thành callus
Trong số các thành phần môi trường thì nguồn và hàm lượng đường là yếu tố quan trọng vì nó làm tăng áp suất thẩm thấu và bổ sung năng lượng cho hoạt động của tế bào. Đối với lúa, nồng độ đường tối ưu theo các tác giả có khác nhau. Theo kết quả nghiên cứu của Chaleff (1982) và Zapata (1986) cho rằng đường sucrose cho hiệu quả nuôi cấy tốt. Nồng độđường cũng ảnh hưởng tới kết quả nuôi cấy, nồng độ sucrose cao làm tăng tỷ lệ tái sinh cây xanh từ
- 85 -
callus, nhưng cũng tạo ra nhiều cây bạch tạng hơn. Theo Phan Hữu Tôn (2004), nồng độ
sucrose 3% cho hiệu quả cao hơn 6% ở hầu hết các giống. Một số tác giả khác cho rằng 6% sucrose là hơi cao, nên giảm xuống còn 4%-5%. Do còn nhiều ý kiến khác nhau, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên 3 nồng độđường khác nhau là 1%, 3%, 5%. Kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.20.
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới sự hình thành callus Môi trường tạo callus
Tổ hợp Chỉ tiêu CT1 CT2 CT3 TB (V) HN 74,17 70,83 71,25 72,08 HT1/IRBB5 TCL 0,83 3,75 2,50 2,36 HN 66,67 58,33 66,25 63,75 LT2/ IRBB7 TCL 0,47 17,92 3,75 7,38 HN 73,75 59,58 70,42 67,91 BT7/ IRBB7 TCL 3,33 5,00 2,08 3,47 HN 65,83 60,83 61,67 62,78 Xi23/IRBB5 TCL 4,58 10,83 7,92 7,78 HN 61,25 56,67 60,41 59,44 ĐB6/IRBB4 TCL 15,42 37,50 11,67 21,53 HN 61,67 56,25 57,92 58,61 KD18/IRBB21 TCL 8,75 41,25 17,92 22,64 HN 67,22 60,42 64,65 64,10 TB (M) TCL 5,56 19,38 7,64 10,86
Chú thích: CT1: N6 + 1% sucrose, CT2: N6 + 3% sucrose, CT3: N6 + 5% sucrose (Các công thức thí nghiệm điều được bổ sung: 2mg/l 2,4-D + 0.5mg/l Kinetin)
HN: tỷ lệ bao phấn hóa nâu (%), TCL, tỷ lệ bao phấn tạo callus (%) TB (1MT): trung bình theo công thức, TB (V): trung bình theo tổ hợp
Qua kết quả trong bảng 3.20 cho thấy, tỷ lệ tạo callus trung bình trên CT2 (19,38%) cao hơn CT3 (7,64%) và CT1 (5,56%). Với từng tổ hợp ta cũng thu được tỷ lệ tạo callus cao nhất trên CT2. Sự chênh lệch này thể hiện rõ nhất tổ hợp LT2/IRBB7 có tỷ lệ tạo callus trên CT2 (17,92%), CT3 (3,75%), CT1 (0,47%). Sức sống của hạt phấn trong bao phấn tạo tiềm năng tái sinh callus của từng kiểu gen nuôi cấy. Việc bổ sung đường vào môi trường nuôi cấy làm tăng áp suất thẩm thấu, cung cấp năng lượng cho các quá trình trao đổi, chuyển hóa của
bao phấn, hạt phấn. Như vậy tỷ lệ tạo callus thu được cao nhất ở CT2 với tất cả các tổ hợp nghiên cứu.
Ngoài ra, quan sát tỷ lệ bao phấn hóa nâu, qua bảng và qua biểu đồ nhận thấy, tỷ lệ
bao phấn hóa nâu thấp nhất trên CT2, tỷ lệ trung bình là 60,42%. Đối với từng tổ hợp khác nhau ta cũng thu được tỷ lệ bao phấn hóa nâu thấp nhất ở CT2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Như vậy môi trường có hàm lượng đường sucrose là 3% thích hợp nhất cho giai đoạn tạo callus. Kết quả này phù hợp với kết quả của Niizeki, ông cho rằng nồng độđường sucrose 3% cho tỷ lệ tạo callus cao hơn cả. Và theo kết quả nghiên cứu của Phan Hữu Tôn (2004) nồng độ sucrose 3% cho hiệu quả nuôi cấy tốt ở hầu hết các giống nghiên cứu.
* Ảnh hưởng của hàm lượng các chất điều tiết sinh trưởng đến sự hình thành callus
Chất điều tiết sinh trưởng có ảnh hưởng to lớn đến kết quả nuôi cấy. Auxin, cytokinin, và abscisic (ABA) rất cần thiết cho việc tạo callus. 2.4-D và α-NAA có tác dụng tạo callus nhưng những callus này lại khó tạo thành cây so với môi trường chỉ cho thêm α-NAA. Nồng
độα-NAA tối ưu khoảng 2mg/l, ở nồng độ này làm tăng quá trình tạo callus và tái tạo thành cây nếu như tăng nồng độ kinetin. Tuy nhiên nồng độ kinetin không nên cao quá 2mg/l vì sẽ
làm tăng tỷ lệ cây bạch tạng. Hiệu quả tác động của các chất điều tiết sinh trưởng phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của chất điều tiết sinh trưởng. Vì vậy trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng cả 2 loại chất điều tiết sinh trưởng bổ sung vào môi trường N6. Trong thí nghiệm chúng tôi bố trí 3 công thức khác nhau về nồng độ α-NAA (1, 2, 3 mg/l) và 0,5mg/l kinetin. Các công thức trên được so sánh với công thức đối chứng: N6 + 0,5mg/l kinetin + 2mg/l 2,4 D, đây là công thức cho tỷ lệ tạo callus tốt nhất trong các thí nghiệm trên. Kết quả thí nghiệm thu được thể hiện trong bảng 3.21.
Qua bảng 3.21 cho thấy, tỷ lệ tạo callus khác nhau ở những nồng độ α-NAA khác nhau. Ở hầu hết các tổ hợp đều cho tỷ lệ tạo callus trên công thức đối chứng cao hơn các công thức còn lại. Sự chênh lệch này thể hiện rõ nhất ở tổ hợp Xi23/IRBB5 và LT2/IRBB7, tỷ lệ
tạo callus lần lượt là 27,08% và 17,92% (ĐC), 7,08% và 7,08% (CT2), 6,67% và 3,75% (CT3), 2,08% và 2,50% (CT4).
Kết quả trung bình theo môi trường cho thấy, tỷ lệ tạo callus cao nhất ở CT1 (12,75%), sau đó
- 87 - Bảng 3.21. Ảnh hưởng của hàm lượng chất điều tiết sinh trưởng đến sự hình
thành callus
Môi trường nuôi cấy Kiểu gen Chỉ tiêu CT1 CT2 CT3 CT4 TB (V) HN 59,58 57,50 70,42 73,33 65,23 HT1/IRBB5 TCL 5,00 2,08 1,25 0,00 2,08 HN 58,33 59,58 67,92 69,58 63,85 LT2/IRBB7 TCL 17,92 7,08 3,75 2,50 7,81 HN 57,92 62,08 65,83 71,25 64,27 BT7/IRBB7 TCL 5,00 2,92 2,08 1,25 2,81 HN 51,67 59,17 57,08 60,42 57,09 Xi23/IRBB5 TCL 27,08 7,08 6,67 2,08 10,73 HN 52,68 58,35 62,45 61,53 58,75 ĐB6/IRBB4 TCL 7,00 5,25 4,80 3,57 5,15 HN 56,65 57,75 61,25 62,76 59,60 KD18/IRBB21 TCL 5,35 5,12 4,75 4,34 4,89 HN 56,86 59,58 65,31 68,65 62,60 TB (M) TCL 12,75 4,79 3,44 1,46 5,86 Chú thích: CT1 (ĐC):N6 +0,5 mg/l Kinetin + 2mg/l 2,4 D; CT2: N6 +0,5 mg/l Kinetin + 1mg/l α-NAA; CT3: N6 +0,5 mg/l Kinetin + 2mg/l α-NAA; CT4: N6 +0,5 mg/l Kinetin + 3mg/l α-NAA các công thức đều được bổ sung 3% đường Sucarose
Như vậy chúng tôi nhận thấy, việc bổ sung vào môi trường các chất kích thích sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau đều cho tỷ lệ bao phấn phát sinh callus khác nhau. Trên môi trường N6 có bổ sung 2mg/l 2,4 D cho tỷ lệ tạo callus cao hơn hẳn các công thức bổ sung α- NAA. Có thể kết luận rằng, 2,4 D ở nồng độ 2mg/l là thích hợp nhất cho sự tái sinh callus. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Niizeki, Nguyễn Văn Uyển và Phan Hữu Tôn.
* Ảnh hưởng của tỷ lệ Kinetin: BA tới khả năng tái sinh cây
Cytokinin kích thích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và phát triển của chồi in vitro. Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sinh trưởng của mô sẹo nuôi cấy, nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến sự phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy.
Cytokinin bao gồm Zeatin, Kinetin, BA ở nồng độ cao được coi là có lợi cho sự tái sinh cây. Trong thí nghiệm tái sinh cây, chúng tôi sử dụng môi trường MS có bổ sung 1mg/l
α-NAA, Kinetin, BA với tỷ lệ Kinetin : BA lần lượt là 1: 0, 1: 1, 1: 2. Thí nghiệm được tiến hành trên 6 tổ hợp, kết quả thu được sau 4 tuần nuôi cấy thể hiện trong bảng 3.22.
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của tỷ lệ Kinetin : BA tới khả năng tái sinh cây Giống Ch(%) ỉ tiêu CT1 CT2 CT3 TB (V) TSCX 0,0 4,5 0,0 1,5 HT1/IRBB5 TSCBT 0,0 22,7 0,0 7,9 TSCX 0,0 5,3 0,0 1,8 LT2/IRBB7 TSCBT 0,0 50,0 16,7 22,2 TSCX 0,0 10,7 3,6 4,8 BT7/IRBB7 TSCBT 0,0 32,1 14,3 15,5 TSCX 0,0 0,0 0,0 0,0 Xi23/IRBB5 TSCBT 0,0 10,0 0,0 3,3 TSCX 0,0 25,0 0,0 8,3 ĐB6/IRBB4 TSCBT 0,0 0,0 37,5 12,5 TSCX 0,0 0,0 0,0 0,0 KD18/IRBB21 TSCBT 0,0 40,0 20,0 20,0 TSCX 0,0 11,9 2,4 4,8 TB (M) TSCBT 0,0 25,0 15,2 13,4
Chú thích: TSCX: Tỷ lệ tái sinh cây xanh; TSCBT: Tỷ lệ tái sinh cây bạch tạng CT1: MS +1mg/l α-NAA + 1mg/l Kinetin + 0mg/l BA; CT2: MS +1mg/l α-NAA + 1mg/l
Kinetin + 1mg/l BA; CT3: MS +1mg/l α-NAA + 1mg/l Kinetin + 2mg/l BA
Qua bảng 3.22 cho thấy ở công thức 1 không có callus nào tái sinh cây được ở tất cả các tổ
hợp. Các công thức còn lại hầu hết các callus của các tổ hợp đều có khả năng tái sinh thành cây. Tỷ
lệ tái sinh giữa các công thức, giữa các tổ hợp có sự biến động, chênh lệch nhau. Tỷ lệ callus tái sinh trung bình cao nhất ở CT2, có tỷ lệ tái sinh cây xanh là 11,9%, tỷ lệ tái sinh cây bạch tạng là 25,0%.
Ở CT3 có tỷ lệ tái sinh cây thấp hơn, tỷ lệ tái sinh cây xanh là 2,4%, tỷ lệ tái sinh cây bạch tạng là 15,2%. Như vậy tỷ lệ tái sinh cây bạch tạng trong thí nghiệm cao hơn so với tỷ lệ tái sinh cây xanh ( tỷ lệ tái sinh cây bạch tạng là 13,4%, tỷ lệ tái sinh cây xanh là 4,8%), hiện tượng này rất phổ biến trong nuôi cấy bao phấn lúa.
Có nhiều nguyên nhân dẫn tới tỷ lệ tái sinh cây bạch tạng cao hoặc callus không tái sinh được thành cây, có thể do kiểu gen phản ứng yếu với môi trường tái sinh, nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy, môi trường nuôi cấy, loại và nồng độ các chất điều tiết sinh trưởng, tuổi của callus khi cấy chuyển. Theo kết quả thí nghiệm, chúng tôi thấy loại và tỷ lệ các chất điều tiết sinh trưởng bổ sung vào môi trường tái sinh có ảnh hưởng rất lớn đến tỷ lệ tái sinh cây. BA và Kinetin cùng thuộc nhóm Cytokinin, vì vậy khi sử dụng BA hoặc Kinetin riêng rẽ thì tác dụng của chúng tương tự nhau. Tuy nhiên qua thí nghiệm chúng tôi nhận thấy, trên CT1 chỉ bổ sung Kinetin thì callus của tất cả các kiểu gen nghiên cứu đều không có khả năng tái
- 89 -
sinh thành cây. Trong CT2 và CT3 chúng tôi bổ sung cả Kinetin và BA vào môi trường thì callus của các tổ hợp nghiên cứu cho khả năng tái sinh cây.
Như vậy chúng tôi đưa ra nhận xét, sự kết hợp giữa Kinetin và BA đã có tác động kích thích qua lại lẫn nhau. Sự tác động qua lại của chúng có tác động đến sự phân hóa hình thái của mẫu nuôi cấy. Chúng tôi kết luận công thức: MS + 1mg/l α-NAA + 1mg/l Kinetin + 1mg/l BA là công thức thích hợp nhất cho sự tái sinh cây của callus. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hiệp (2007).
Hình 3.20. Callus tạo điểm xanh, phát triển thành chồi xanh và bạch tạng của tổ hơp KD18/IRBB21
*Giai đoạn nhân nhanh cây in vitro và xử lý đa bội thể
Nhân giống vô tính in vitro là quá trình sản xuất một lượng lớn cây hoàn chỉnh từ các bộ phận cơ quan của cây mẹ ban đầu bằng kỹ thuật nuôi cấy mô. Phương pháp nhân nhanh in vitro có ưu điểm là cho hệ số nhân chồi cao và cho ra các cá thể tương đối đồng nhất về mặt di truyền. Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Lý Anh thì môi trường nhân chồi là môi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});