Yêu cầu:
- Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường Wakimoto ở 28ºC sau 48 đến 72 giờ, đảm bảo tính thuần khiết, sinh trưởng tốt và giữ nguyên được tính độc.
- Lây nhiễm vào giai đoạn cây lúa cuối đẻ nhánh đến phân hoá đòng, lúc lây nhiễm lá lúa phải khô, thời tiết thoáng mát khô ráo và ít nhất 3 giờ sau khi lây nhiễm trời không có mưa.
- Không lây nhiễm sót mẫu.
Cách tiến hành:
- Lấy 3 vòng que cấy vi khuẩn hoà trong 10ml nước cất vô trùng, trộn đều vi khuẩn bằng máy votex 5000 vòng/phút, đảm bảo mật độ 108-1010 CFU/ml. Lây nhiễm theo phương pháp cắt kéo: (Furuya và cộng sự, 2001). Kéo đã khử trùng ở 121ºC, trong 20 phút được nhúng vào dung dịch vi khuẩn rồi cắt ít nhất 5 lá lúa, cách ngọn 3 - 5cm. Chú ý, với mỗi chủng vi khuẩn lây nhiễm cần được buộc thẻ ký hiệu và sử dụng một kéo riêng biệt; đặt ống vi khuẩn nơi râm mát, tránh ánh sáng chiếu trực tiếp làm giảm độc tính vi khuẩn.
Đánh giá kết quả sau lây nhiễm:
- Sau lây nhiễm 18 - 20 ngày tiến hành đo chiều dài vết bệnh trên lá, đo 5 lá/Isolate/dòng chỉ thị. Đo đến vết bệnh cuối cùng, phần tiếp giáp giữa mô khoẻ và mô bệnh.
- Chỉ tiêu đánh giá vết bệnh: Chiều dài vết bệnh (d) (cm) Phản ứng Ký hiệu d <8 Kháng R d = 8 đến 12 Kháng trung bình M d >12 Nhiễm S
- 37 -
2.2.5. Xác định đa dạng di truyền DNA của các mẫu vi khuẩn Xoo bằng pháp rep PCR và IS-PCR
* Phương pháp rep-PCR (repetitive sequence-based PCR)
Là phương pháp sử dụng để nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên sựđa hình về các trình tự lặp lại trong bộ genome của vi khuẩn nghiên cứu, những trình tự này là bảo thủ giữa các chủng vi khuẩn nên có thể sử dụng chúng để nghiên cứu sựđa dạng của các chủng trong cùng một loài.
Sử dụng mồi đơn ERIC2F (Vera Cruz, 2003) và mồi BOXA1RF (Adhikari, 1999) với trình tự như sau:
Tên mồi Trình tự
ERIC2F 5’ – AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG – 3’
BOXA1RF 5’- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG - 3’
+ Thành phần phản ứng PCR : : 1x Taq buffer; 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dNTPs; 0.2 µM primer ERIC2F ( và primer BOXA1RF); 1.25U Taq DNA polymerase; 2 µl DNA tempale solution còn lại là water PCR, tổng cộng là 25µl.
+ Chu trình nhiệt độ trong PCR: nâng lên 95oC trong 7phút, hoàn thành 35 chu kì với 94oC trong 1 phút – 48oC (với ERIC2F) và 53oC (với mồi BOXA1RF) trong 2 phút – 72oC trong 1 phút, sau đó giữở 72oC trong 7 phút và cuối cùng là bảo quản ở 4oC.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%. Số đoạn băng nhân lên của từng mẫu được thống kê dưới dạng nhị thức và sử dụng phần mềm NTSYSpc2.0 để phân tích,
đánh giá sựđa dạng của các mẫu vi khuẩn.
- Phương pháp IS-PCR (insertiton sequence-based PCR)
+ Theo Adhikari, 1999 thì trong bộ genome của vi khuẩn Xoo có nhiều nhóm các trình tự chèn với kích thước, số lượng khác nhau. Ông đã chỉ ra rằng 2 trình tự IS1112 và IS1113 sẽ thể hiện tốt nhất sựđa dạng giữa các chủng Xoo. Sử dụng kỹ thuật IS-PCR với mồi đơn J3F [5’ – GCTCAGGTCAGGTCGCCTGG – 3’] cho phép nghiên cứu 2 trình tựđó.
+ Thành phần phản ứng PCR: 1x Taq buffer; 1.5 mM MgCl2; 0.2 mM dNTPs; 0.2 µM primer J3F; 1.25U Taq DNA polymerase; 2 µl DNA template solution còn lại là water PCR, tổng cộng là 25µl.
+ Chu trình nhiệt độ trong PCR: nâng lên 95oC trong 7 phút, hoàn thành 30 chu kì tại 94oC trong 1 phút – 48oC trong 2 phút – 72oC trong 1 phút, sau đó giữở 72oC trong 7 phút và cuối cùng là bảo quản ở 4oC. Sản phẩm PCR điện di trên gel agarose 1%. Sốđoạn băng nhân
lên của từng mẫu cũng được thống kê dưới dạng nhị thức và sử dụng phần mềm NTSYSpc2.1
để phân tích, đánh giá sựđa dạng của các mẫu vi khuẩn.