2.8.8.1. Nuôi cấy vi khuẩn
Phương pháp được tiến hành theo N. Furuya và cộng sự, 2003 (đã mô tảở trên)
2.8.8.2. Chiết tách DNA tổng số của vi khuẩn
- Theo phương pháp của Adachi , 1990 (đã mô tảở trên)
2.8.8.3. Nhân dòng gen avrXa7
1). Cắt DNA genome vi khuẩn Xoo bằng các enzyme cắt giới hạn
- DNA genome của mỗi chủng vi khuẩn sau khi chiết tách được cắt riêng bằng từng RE BamHI và EcoRI , 370C ủ qua đêm.
2). Điện di sản phẩm cắt và thu đoạn DNA đặc trưng cho avrXa7 từ gel
- Chạy điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% (với mẫu cắt bằng BamHI) và 1,5 % (với mẫu cắt bằng EcoRI): Kích thước bản gel 20 × 18 cm, hiệu điện thế 50V, chạy điện di trong 25 – 36h ởđiều kiện nhiệt độ 4oC, có kèm ADN ladder 1kb. Nhuộm bản gel trong dung dịch Ethilium bromide và kiểm tra kết quả trong buồng chụp UV.
- So sánh các băng điện di với ADN ladder để xác định vị trí các đoạn 4,2 BamHI và 1,3 EcoRI.
- Xác định vị trí của các đoạn 4,2 BamHI và 1,3 EcoRI trong buồng chụp UV, cắt thu phần gel chứa các đoạn trên.
- Sử dụng Kit (Qiagen, Valencia, CA 91355) tinh sạch DNA từ gel.
3). Chèn đoạn DNA mục tiêu vào phagemid vector
- Sau khi xác định được hàm lượng của mẫu DNA thu được, sử dụng TE để pha loãng sao cho nồng độ của DNA tương đương với nồng độ của phagemid vector.
Chèn đoạn DNA mục tiêu vào phagemid vector
Xác định hàm lượng DNA và phagemid vector
- Sử dụng phương pháp so màu quang phổ xác định hàm lượng ADN: đo độ hấp phụ
của DNA ở bước sóng λ = 260 nm bằng máy quang phổ kế. Từđộ hấp phụ tính toán hàm lượng DNA có trong mẫu, với A260 = 1,0 OD tương đương 50 µg/ml ddDNA sợi kép.
Thành phần phản ứng gồm: Vector pBluescript II KS (0,1 µl/ml) 1 µl ADN mục tiêu (0,1 µl/ml) 2 µl 10 mM rATP (pH 7.0) 1 µl 10× Ligase buffer 1 µl T4 DNA ligase (4 U/µl) 0,5 µl Nước cất vô trùng 5,5 µl Tổng thể tích 10 µl
Phản ứng được tiến hành ởđiều kiện nhiệt độ phòng (220C) trong thời gian 2 giờ hoặc
để qua đêm ở nhiệt độ 40C. Ủ tiếp hỗn hợp qua đêm ở nhiệt độ 12 – 140C. 4). Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn nhận
Vi khuẩn sử dụng làm chủng chủ là E.coli chủng XL1-Blue MRF´.
- Tạo tế bào khả biến: Xử dụng phương pháp xung điện hoặc xử lý hóa chất (CaCl2)
để tạo tế bào khả biến.
- Biến nạp phagemid tái tổ hợp vào tế bào nhận.
5). Chọn lọc vi khuẩn mang phagemid tái tổ hợp
- Sau quá trình biến nạp, vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường LB có bổ sung chất X-gal, kháng sinh ampicillin và IPTG. Vector pBluescript II KS mang gen kháng kháng sinh ampicillin, nên chỉ những vi khuẩn có vector chuyển nạp mới có khả năng sống được trên môi trường có chất kháng sinh ampicilin.
- 41 -
- Mặt khác, vector tái tổ hợp là vector có DNA chèn vào vùng gen lac-z nên làm gen này không hoạt động. Vì vậy, vi khuẩn mang vector không có DNA cài vào sẽ tạo khuẩn lạc màu xanh, còn vi khuẩn mang vector tái tổ hợp sẽ tạo khuẩn lạc màu trắng khi nuôi trên môi trường có chất X-gal.
2.8.8.4. Giải trình tự gen avrXa7
Giải trình tự gen avrXa7 được thực hiện dựa theo phương pháp của Ponciano, năm 2004. Trình tự của gen avrXa7được xác định dựa vào giải trình tự các đoạn 4,2 BamHI và 1,3 EcoRI. Gồm các bước:
1). Giải trình tự hai dầu 5’ và 3’ đoạn 4,2 BamHI
Thực hiện giải trình tự tựđộng sử dụng các mồi đặc trưng kết hợp với mồi của vector
để giải trình tự hai đầu 5’ và 3’ của avrXa7
avr7N primer 5’- AACCCTCCGACGCTTC -3’
p7NR primer 5’-CAGGGGGGCACCCGTCAGTGC -3’
avr7hinc for primer 5’- GCCCAGTTATCTCGCCC -3’
avr7hinc primer 5’- CGATTGATTCTTCTGAT -3’
avr7BamHI primer 5’- GATCCTGGTTACGCGG -3’
Kết hợp với mồi đặc thù của vector
T3 primer 5’- AATTAACCCTCACTAAAGGG -3’
T7 5’- GTAATACGACTCACTATAGGGC -3’
2). Giải trình tự vùng lặp avrXa7
Do vùng trung tâm của gen avrXa7 có 25.5 bản copy của trình tự lặp 102 bp, khó xác
định vị trí gắn mồi giải trình tự, do đó sử dụng phương pháp chèn Transposon vào đoạn 4,2 BamHI để tạo vị trí gắn mồi thực hiện phản ứng giải trình tự. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng Transposon là EZ::Tn5TM <KAN-2>. Transposon EZ::Tn5TM <KAN-2> dài 1221 bp, có gen kháng kháng sinh kanamycin, có 1 vị trí cắt của RE BamHI.
Chuẩn bị ADN mục tiêu:
+ Sử dùng Kit (Qiagen, Valencia, CA 91355) chiết tách plasmid tách phagemid tái tổ
hợp từ các vi khuẩn đã chọn lọc.
+ Phagemid mang đoạn 4,2 BamHI sau khi chiết tách được dùng làm ADN mục tiêu
để thực hiện phản ứng chèn Transposon. Phản ứng chèn Transposon
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng chèn Transposon
EZ::Tn5 10X Reaction Buffer 1 µl DNA mục tiêu 2 µg EZ::Tn5 <KAN-2> Transposon 1µl Nước cất vô trùng 5µl EZ::Tn5 Transposase 1 µl Tổng thể tích 10 µl + Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC trong 2 giờ.
+ Thêm 1 µl EZ::Tn5 10X Stop Solution để dừng phản ứng. Trộn đều và để hỗn hợp ở
70oC trong 10 phút.
Giải trình tự vùng lặp avrXa7
- Biến nạp ADN vào tế bào vi khuẩn: Sử dụng E.coli chủng XL1-Blue MRF´.
- Chọn lọc vi khuẩn mang phagemid chứa đoạn chèn Transposon: Nuôi cấy vi khuẩn sau khi biến nạp trên môi trường LB, bổ sung 50 µg/µl kháng sinh kanamycin. Do Transposon EZ::Tn5TM <KAN-2> có gen kháng kanamycin nên chỉ những vi khuẩn mang phagemid tái tổ hợp có đoạn chèn Transposon mới có thể sống trên môi trường chọn lọc. Giải trình tự vùng lặp
+ Vùng lặp avrXa7 được giải trình tự tự động hai hướng sử dụng cặp mồi đặc trưng cho Transposon là KAN-2 FP-1và KAN-2 RP-1.
KAN-2 FP-1 5’- ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC -3’ KAN-2 RP-1 5’- GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAG -3’
+ Lập bản đồ vị trí chèn của Transposon: Do Transposon chèn vào DNA đích một cách ngẫu nhiên phụ thuộc vị trí cắt của Transposase, do đó cần lập bản đồ vị trí chèn của
- 43 -
Transposon với mục đích chọn các dòng thích hợp cho mỗi chủng để giải trình tự. Sau khi chọn được các dòng thích hợp, tiến hành giải trình tự sử dụng cặp mồi vector sau:
5.3.Giải trình tựđoạn 1,3 EcoRI
Trình tự 174 bp bị thiếu khi cắt avrXa7 bằng RE BamHI thu được thông qua giải trình tựđoạn 1,3 EcoRI, sử dụng cặp mồi:
Cterm1: 5’-GGGCCAAACCGTCCCCTACT-3’ 9bRev: 5’-TCGGCAGGGATTCGTGTAA-3’
Trình tự gen avrXa7được xác định dựa vào trình tự của các đoạn đặc trưng được giải trình tựở trên, sử dụng phần mềm ClustalW