Phương pháp tạo mô sẹo từ phôi hạt lúa chín
+ Chọn những hạt chắc mẩy, quan sát bằng mắt không thấy dấu vết của nấm bệnh. Hạt lúa khô được bóc vỏ, chọn những hạt tróc vỏ và còn nguyên phôi cho vào lọ nút nhám và khử
trùng theo trình tự sau: 1 phút trong cồn 70%, lắc nhẹ 10 phút trong dung dịch HgCl2 nồng độ
0,1% , tráng lại bằng nước cất vô trùng 5-6 lần, sau đó chuyển hạt lên đĩa petri có trải giấy lọc vô trùng cho thấm khô nước bám quanh hạt .
- 45 -
+ Hạt gạo đã được khử trùng và cấy trên các môi trường MS và N6 cơ bản có bổ sung 2.4D theo các công thức đã được chuẩn bị trước: Dùng pank gắp nhẹ hạt lúa đã được khử
trùng đặt lên môi trường. Sử dụng bình nuôi cấy là bình trụ hình nhỏ có chứa 10ml môi trường. Mỗi bình cấy 4 -5 hạt, khoảng cách giữa các hạt phải đồng đều. Cần lưu ý là mật độ
cấy có ảnh hưởng khá lớn tới kết quả nuôi cấy phôi, nếu cấy với mật độ quá lớn sẽ làm dinh dưỡng trong bình bị thiếu hụt, chất thải nhiều làm ảnh hưởng tới chất lượng callus. Nếu thao tác cấy quá lâu sẽ làm tăng nguy cơ nhiễm mẫu ảnh hưởng tới kết quả nghiên cứu sau này.
+ Sau khi cấy xong, các mẫu sẽđược đưa vào các tủ định ôn tối ở nhiệt độ cố định 270C trong 1 tuần. Sau đó chuyển ra nuôi ở phòng sáng với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ từ 25 - 270C. Khoảng 2-3 tuần, khi khối callus hình thành thì tiến hành đáng giá khả năng tạo callus.
Phương pháp xử lí đột biến mô sẹo lúa bằng chiếu xạ tia gamma từ Co60
Sau khi callus 3 tuần tuổi, lúc này callus đạt được màu sắc và kích thước đẹp, ổn định và khả năng sống, chống chịu cao (Scowcroft et al.1985). Ta tiến hành chọn các callus đẹp (kích thước đồng đều và màu vàng sáng, xốp) cấy lên môi trường nhân callus (MS + 3% Saccharoza + 0,8% agaroza + 1mg/l 2.4 D).
Chú ý: Khi ta cấy chuyển lên môi trường nhân callus thì giữ nguyên vẹn callus không
được tách nhỏ cũng như cắt bỏ phần thừa để tránh gây tổn thương callus trước khi đi xử lý phóng xạ.
Các bình đựng callus được xếp trong thùng lạnh để đem callus đi xử lý phóng xạ. Callus được chiếu xạ từ nguồn Co60 với các liều lượng, 1 Krad, 3 Krad, 5 Krad, 7Krad. Mẫu
được chiếu xạ tại Trung tâm chiếu xạ Quốc gia - Xã Minh Khai - Từ Liêm – Hà Nội.
Sau khi chiếu xạ 1 tuần ta tiến hành đánh giá khả năng sống sót của các callus sau khi chiếu xạở các liều lượng khác nhau. Sau đó những callus sống sót ta tiến hành tách khối nhỏ khoảng 2 – 3 mm và tiếp tục cấy lên môi trường nhân callus.
Phương pháp chiết tách dung dịch vi khuẩn của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae
• Nguồn vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae
Sử dụng 2 nhóm chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae gây bệnh bạc lá chủng 2 và 3 rất phổ biến và tồn tại ở hầu hết các vùng trồng lúa ở Miền Bắc Việt Nam, do KS.Tống Văn Hải (Bộ môn CNSH- Trường ĐHNN Hà Nội ) cung cấp.
Vi khuẩn được dự trữ và bảo quản trong môi trường sữa milk ở -300C được cấy truyền sang môi trường Wakimoto ở nhiệt độ, 280C.
• Cách chiết tách dung dịch vi khuấn Xanthomonas Oryzae:
Sau khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Wakimoto ở nhiệt độ, 280C, PH=7, 48h tuổi, lấy 3 vòng que cấy vi khuẩn cho vào 10ml nước cất vô trùng, dùng que cấy đánh tan, sau
đó chuyển sang ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút và lọc bằng màng lọc vi khuẩn có
đường kính 0.22 µm. Các bước tiến hành :
- Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Wakimoto trong 48h.
- Bước 2: Pha loãng vi khuẩn bằng nước cất vô trùng và đánh tan (lấy khoảng 3 vòng que cấy vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzaecho vào 10ml nước cất vô trùng).
- Bước 3: Đem dung dịch đi ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút. Sau li tâm hút lấy phần dịch trong và bỏ phần cặn.
- Bước 4: Dùng màng lọc MillexR- CTV lọc lấy phần nước trong. - Bước 5: Bảo quản dung dịch vi khuẩnXanthomonas oryzae ở t0 2 - 50C.
Lưu ý: Sau khi li tâm hút phần dịch trong cho vào một bình thủy tinh vô trùng. Sau đó tiến hành bước 4 trong bốc cấy vô trùng. Để đảm bảo dung dịch thu được hoàn toàn vô trùng phục vụ cho các thí nghiệm sau.
Phương pháp xử lý dung dịch vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae đối với callus lúa
• Cách pha loãng vi khuẩn:
Ta coi dung dịch vi khuẩn thu được sau quá trình chiết tách của các chủng 2, chủng 3 là dung dịch vi khuẩn nguyên chất (100%) làm cơ sởđể pha loãng dung dịch.
Tiến hành pha loãng làm 3 mức đối với dung dịch vi khuẩn của cả 2 chủng:
+ Mức 1: Không pha loãng, dùng ống pipet hút 10ml dung dịch vi khuẩn của các chủng 2, chủng 3 lần lượt cho vào các ống nghiệm đã được hấp vô trùng.
+ Mức 2: Pha loãng 1 lần (pha loãng 50%), dùng ống pipet hút 10ml dung dịch vi khuẩn của các chủng 2, chủng 3 và 10ml nước cất vô trùng lần lượt cho vào các ống nghiệm
- 47 -
+ Mức 3: Pha loãng 2 lần (pha loãng 33,33%), dùng ống pipet hút 10ml dung dịch vi khuẩn của các chủng 2, chủng 3 và 20ml nước cất vô trùng lần lượt cho vào các ống nghiệm
đã được hấp vô trùng.
• Cách xử lý dung dịch vi khuẩn đối với callus:
+ Xử lý trên các callus còn sống sót của giống lúa ở các liều chiếu xạ khác nhau 1 Krad, 3Krad, 5Krad, 7Krad.
+ Các dung dịch độc tố chủng 2, chủng 3, và các callus cần xử lý ta lần lượt bố trí thí nghiệm theo 3CT.
CT1: Không pha loãng CT2: Pha loãng 1 lần
CT3: Pha loãng 2 lần
+ Dùng pank vô trùng gắp từng mẫu callus cho vào ống nghiệm đựng dung dịch vi khuẩn theo các liều pha loãng khác nhau sao cho mẫu callus chìm trong dung dịch đó. Ngâm mẫu trong dung dịch vi khuẩn khoảng 10 phút sau đó chuyển mẫu lên đĩa petri có trải giấy lọc vô trùng cho thấm khô dung dịch vi khuẩn bám quanh hạt. Sau đó dùng pank cấy mẫu vào môi trường nhân callus đã chuẩn bị sẵn.
+ Sau 1 tuần tiến hành đánh giá khả năng sống sót của callus sau xử lý dung dịch vi khuẩn.
Nghiên cứu khả năng tái sinh cây sau xử lý dung dịch vi khuẩn
+ Những callus sống sót sau khi xử lý dung dịch vi khuẩn được cấy chuyển lên trên môi trường tái sinh cây (MS + 3% Saccharoza + 0,8% agaroza + 0,2mg/l NAA + 2mg/l BAP), nuôi ở nhiệt độ 27 ± 10C, cường độ ánh sáng là 2000 lux, thời gian chiếu sáng là 16 giờ/ ngày. Sau 4 tuần nuôi cấy tiến hành đánh giá khả năng tái sinh của callus sống sót.
+ Sau đó các chồi tái sinh được tách thành các dòng cây và cấy chuyển lên môi trường tái sinh cây hoàn chỉnh (MS + 3% Saccharoza + 0,8% agaroza + 0,2mg/l NAA).
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN