Sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ gen đã mang đến những bước tiếng đáng kể trong nghiên cứu và chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá. Vi khuẩn
Xanthomonas oyzae pv. oyzae có thểđược xác định nhanh chóng bằng cách sử dụng các chỉ
thị phân tử. Adachi và T. Oku (2000) đề xuất sử dụng 2 đoạn mồi XOR-F và XOR-R2 để
nhân đoạn DNA, đoạn DNA này nằm giữa hai gen tổng hợp nên cấu tử 16S và 23 S của ribosome vi khuẩn bạc lá (Phan Hữu Tôn, 2005).
Ngoài ra, các kỹ thuật phân tử như RFLP (restriction fragment length polymorphism) cũng được áp dụng thành công trong việc xác đánh giá sựđa dạng hay xác định chủng mới của vi khuẩn Xoo ở Việt Nam, Phillipnes, Hàn Quốc và những nước trồng lúa khác (Adhikari, 1995; Yashitola, 1997; Etham Ghasemie, 2008; Phan Hữu Tôn,2009).
Ngày nay, đã có nhiều gen quan trọng của các loại cây trồng được lập bản đồ liên kết với các đoạn DNA genome, đặc biệt là gen kháng bệnh ở các cây lương thực chính (Melchinger, 1990; Kelly, 1995; Penner và cộng sự, 1995; Miklas và cộng sự, 1996 ) (dẫn theo A.C.Sanchez) [12]. Dựa trên bản đồ này, chỉ thị phân tử xác định gen kháng bạc lá đã
được xây dựng. Kỹ thuật này ngày càng được sử dụng phổ biến bởi tính khả thi, tính hiệu quả
- 31 -
(Nelson và cộng sự, 1996) [34], trong việc tổ hợp nhiều gen kháng để tạo thành giống chứa
đa gen kháng (Huang và cộng sự, 1997), trong chuyển gen kháng bằng phương pháp nuôi cấy mô, lai tế bào trần (Kelly, 1995).
Tại Việt Nam, chỉ thị phân tửđã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu bệnh bạc lá và chọn tạo giống lúa kháng bệnh ở các trung tâm chọn giống.
Từ năm 1997-2004, Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đã sử dụng phương pháp sử
dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lây nhiễm nhân tạo bằng 9 race vi khuẩn phổ biến trong đánh giá khả năng kháng bệnh của 348 giống lúa địa phương thu thập được ở duyên hải Trung Bộ
và đồng bằng sông Cửu Long. Kết quảđã thu được 17 giống mang gen xa13, 6 giống mang gen Xa4, 4 giống mang gen xa5, 3 giống mang gen Xa7, 3 giống mang gen Xa14. Kiểm tra độ
tin cậy của phương pháp chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phát hiện gen kháng ở quần thể con lai giữa IR24/Barer đối với gen xa5 cho thấy độ chính xác lên tới 93,3% (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004). Bùi Chí Bửu và Cộng sự cũng đã sử dụng chỉ thị phân tử để kiểm tra tổ hợp BC4F4 của IR24 với giống lúa địa phương mang gen kháng Xa4, xa5, xa13 với độ
chính xác cao.
Ở miền Bắc, chỉ thị phân tửđã được ứng dụng thành công trong nghiên cứu bệnh bạc lá và chọn giống kháng bệnh. Từ năm 2000 cùng với sự hợp tác của các chuyên gia Nhật Bản trong khuôn khổ dự án Jica, nhóm nghiên cứu về bệnh bạc lá của trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội của Phan Hữu Tôn và cộng sự đã liên tục công bố nhiều kết quả nghiên cứu quan trọng. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng chỉ thị phân tử và kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn để tiến hành thu thập, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn bạc lá phổ biến ở miền Bắc. Đồng thời, để
phục vụ cho chiến lược chọn tạo giống lúa kháng bệnh, Phan Hữu Tôn cũng tiến hành lây nhiễm trên các dòng đẳng gen nhằm kết luận gen kháng hữu hiệu với các chủng vi khuẩn ở
miền Bắc. Cho đến nay, các gen xa5, Xa7, Xa21đã được xác định là các gen kháng hầu hết các chủng vi khuẩn. Các giống lúa nhập nội từ Trung Quốc cũng được tiến hành đánh giá khả
năng kháng bệnh, kết quả cho thấy chúng không có khả năng kháng các chủng vi khuẩn ở
Việt Nam.
Trong các năm 2000-2005, Phan Hữu Tôn và cộng sự tiến hành việc tìm kiếm nguồn gen kháng từ các giống lúa địa phương bằng cả hai phương pháp lây nhiễm nhân tạo và PCR. Năm 2000, theo kết quả nghiên cứu đã công bố của Phan Hữu Tôn thì trên cơ sởđiều tra 145 giống lúa địa phương đã phát hiện được 12 giống chứa gen xa5 và 2 giống chứa gen Xa7. Năm 2004, trên cơ sở tiếp tục điều tra 120 giống địa phương, Phan Hữu Tôn và cộng sự phát
hiện được thêm 8 giống lúa địa phương chứa gen xa5. Các kết quả nghiên cứu trên đều nhằm mục đích phục vụ cho chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam.
Đến nay, bước đầu có thể khẳng định các gen Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, xa13, Xa14 là các gen kháng thường có mặt trên các giống lúa địa phương ở Việt Nam. Các gen kháng Xa4, xa5, Xa7, Xa21 là các gen có ý nghĩa quan trọng trong việc chọn tạo giống lúa kháng bệnh, bởi chúng có khả năng kháng được hầu hết các chủng vi khuẩn phổ biến ở nước ta. Nhưng trong số các gen kháng hữu hiệu, tại miền Bắc thì gen Xa7 có khả năng xuất hiện nhiều hơn
xa5. Hiện chưa có nghiên cứu nào công bố việc phát hiện được gen Xa21 trên các giống lúa trồng. Việc sử dụng kỹ thuật PCR xác định gen kháng và vi khuẩn bạc lá trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh cho kết quả rất khả quan.
- 33 - CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU