Lấy mẫu và xử lý mẫu
- Thời gian lấy đòng lúa từ 8-10 giờ sáng. Chọn và lấy đòng lúa sạch bệnh từ thân chính và có khoảng cách từ tai lá đòng đến gối lá đòng là 5-7cm.
- Các đòng lúa lấy vềđược cắt tỉa các lá già, các phiến lá. Đòng lúa được bọc kín trong giấy báo ẩm rồi đặt trong túi nilon và buộc chặt để trong tủ lạnh 70C trong 7 ngày.
Khử trùng mẫu trong buồng cấy
- Khử trùng hoa lúa: Trước khi bóc đòng lúa ra khởi bẹ lá đòng, dùng cồn 700 lau thật kỹ lá đòng. Để vào buồng cấy vô trùng, sau đó mới bóc đòng ra khỏi bẹ lá đòng và cắt thành từng gié. Chọn những gié ở giữa bông, (các hoa ởđây chứa nhiều hạt phấn 1-2 nhân) và các hoa trên gié có màu xanh nhạt hoặc đầu vỏ trấu có màu xanh và chiều dài bao phấn nằm trong khoảng 1/3 -1/2 chiều dài vỏ trấu.
Khử trùng hoa lúa bằng cồn 700 trong 1 phút, dung dịch HgCl2 0.1% trong 30 giây, rồi rửa 3-4 lần bằng nước cất vô trùng.
Cấy bao phấn để tạo callus
Cắt nhẹđuôi hoa lúa, dùng panh kẹp mỏ hạt và gõ nhẹđể bao phấn rơi trực tiếp vào môi trường nuôi cấy hoặc dùng panh nhỏ gắp bao phấn đặt vào môi trường tạo callus đã chuẩn bị
sẵn. Các bao phấn được sắp xếp ngẫu nhiên, mật độ bao phấn trong một bình thí nghiệm phụ
thuộc vào diện tích bình thí nghiệm (thường 30-40 bao phấn trong bình thí nghiệm chứa 20ml môi trường). Đặt mẫu trong buồng tối ở nhiệt độ 250C. Số lượng bao phấn được kiểm tra hàng tuần bắt đầu từ tuần thứ 2 sau nuôi cấy.
Môi trường nuôi cấy.
Môi trường nuôi cấy pha xong được điều chỉnh pH = 5.8 rồi rót vào các lọ, hấp vô trùng ở 1210C trong 20 phút. Các môi trường được sử dụng là N6, He5, MS tổng hợp.
Các chỉ tiêu theo dõi Thời kỳ nuôi cấy bao phấn
Tổng số bao phấn hóa nâu Tỷ lệ hóa nâu (%) =
Tổng số mẫu cấy x 100
Tổng bao phấn tạo callus Tỷ lệ tạo callus (%)=
Tổng số mẫu cấy x100
Giai đoạn tái sinh
Tổng số callus tạo cây Tỷ lệ callus tái sinh (%) =
Tổng số callus cấy x 100 Tổng số cây bạch tạng Tỷ lệ cây bạch tạng (%) = Tổng số cây tạo thành x 100 Tổng số cây xanh Tỷ lệ cây xanh (%) = Tổng số cây tạo thành x 100 Thí nghiệm ngoài vườn
Đểđánh giá khả năng thích nghi của cây in vitro với điều kiện tự nhiên
Tổng cây sống Tỷ lệ cây sống (%) = Tổng cây ra giá thể x 100 Tổng cây chết Tỷ lệ cây chết (%) = Tổng cây ra giá thể x 100