Chiết tách DNA loài vi khuẩn:
- Lấy 1 vòng vi khuẩn 2 - 3 ngày sau nuôi cấy cho vào ống eppendorf có chứa 60µl dịch chiết protease K (50µg/ml trong 10mM Tris-HCl pH = 7.5 và 1mM EDTA pH = 8), quấy làm phân tán đều tế bào vi khuẩn.
- Đặt vào máy gia nhiệt ở 56oC trong vòng 15 phút, để protease K phân giải tế bào vi khuẩn.
- Chuyển nhanh sang tủ sấy ở 80oC, sốc nhiệt làm bất hoạt enzyme, trong 15 phút. Sau đó ly tâm tốc độ 13000 (vòng/phút), trong 10 phút.
- Hút phần dịch trong phía trên chuyển sang một ống eppendorf mới, bảo quản ở 4oC.
Kiểm tra độ tinh sạch của DNA:
- Điện di 5µl DNA vi khuẩn trên gel agarose 1%, hiệu điện thế 70V trong 60 phút, nhuộm Ethydium bromide trong 10 phút, hiện hình trong buồng chụp UV, mẫu chiết tách thành công sẽ xuất hiện 1vệt sáng rõ nét trên bản gel
Thực hiện phản ứng PCR:
- Sử dụng cặp mồi XOR - R2 và XOR – F để xác định loài vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa Adachi và T. Oku (2000)
Tên mồi Trình tự mồi
XOR - R2 5’- CTCGGAGCTATATGCCGTGC - 3’
XOR - F 5’- GCATGACGTCATCGTCCTGT - 3’
Thành phần 1 phản ứng: 1x Taq buffer; 2.5mM MgCl; 0.2mM dNTPs; 0.2mM primer XOR - R2; 0.2mM primer XOR - F; 1.25U taq DNA polimerase; 2µl DNA vi khuẩn, còn lại water PCR, tổng thể tích 25µl.
Chu trình nhiệt: 94oC trong 30 giây → hoàn thành 30 chu kỳ (với 94oC trong 1 phút → 60oC trong 30 giây → 72oC trong 1phút) → 72oC trong 7 phút và bảo quản sản phẩm PCR ở 4oC.
Điện di kiểm tra kết quả:
Điện di sản phẩm trên gel agarose 1%, hiệu điện thế 65V trong vòng 60 phút, nhuộm bản gel bằng Ethydium bromide trong 10 phút, hiện hình trong buồng chụp UV. Những mẫu chính xác là vi khuẩn Xoo sẽ có vệt DNA nhân lên, kích thước 470 bp.