tế bào kháng độc tố.
Có một số giống lúa nhiễm bệnh bạc lá rất nặng nhưng lại có năng suất và chất lượng như: N18, HT1, ĐB6, SS1 và Nếp 87. Chúng tôi đã sử dụng những giống này làm nguồn vật liệu
để gây tạo đột biến invitro, vì đây là những giống có khả năng tái sinh callus cao.
* Tạo callus
Hạt chín của các giống được nuôi cấy trên môi trường MS + 3% saccarose + 2 mg/l 2,4-D + 0.1mg/l α - NAA + 0.2 mg/l BAP để tạo callus. Sau 2 – 3 ngày vào mẫu thì hạt bắt
đầu nảy mầm, xuất hiện rễ mầm và chồi mầm, chưa thấy callus xuất hiện. Sau khoảng 5 ngày thì callus xuất hiện, callus xuất hiện từ phần rễ mầm chứ không phải từ nội nhũ. Có 2 kiểu callus, kiểu 1: Callus có màu vàng sáng, xốp và bóng, phát triển như tản nấm, bao phủ lấy hạt, nội nhũ tiêu biến đi còn lại lớp vỏ bao ngoài. Những callus theo kiểu này thường xốp chắc, có khối lượng cao và có sức tái sinh tốt thích hợp cho việc cấy chuyển tái sinh thành cây. Kiểu 2: Callus phát triển rời rạc, không tạo thành khối liền, mô callus ướt, có trọng lượng nhỏ, khả năng tái sinh kém. Những callus này thường không tốt cho việc cấy chuyển và tái sinh.
- 79 -
Hình 3.15.b. Các kiểu callus hình thành khi nuôi cấy phôi lúa chín
Trong số 5 giống thí nghiệm thì cả 5 giống đều cho tỷ lệ callus kiểu 1 cao, cao nhất là nếp 87
* Xử lý phóng xạ gây tạo đột biến
Callus của các giống HT1, ĐB6, N18, SS1, Nếp 87 khi đạt kích thước (4-6mm) được
đem xử lý chiếu xạ bằng tia gamma (Co60) trong khoảng thời gian 60 phút với 5 công thức CT1: 0 (Krad) (ĐC), CT2: 1 (Krad), CT3: 3 (Krad), CT4: 5 (Krad), CT5: 7 (Krad), mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 60 mẫu.
Sau xử lý các callus gần như không sinh trưởng. Đa số callus vẫn giữ được màu sắc ban đầu: Màu vàng sáng, xốp, nhưng có một số callus chuyển sang màu vàng sậm và có hiện tượng hóa nâu. Càng xử lý với liều lượng cao hơn thì khả năng sống sót của callus càng giảm. Các callus không xử lý ở CT1: 0 (Krad) thì sinh trưởng và phát triển tốt, một số callus bắt đầu hóa xanh. Sau 1 tuần xử lý chiếu xạ các callus sống sót bắt đầu phình to hơn. Sau10 ngày xử
lý, callus trở lại trạng thái bình thường chúng tôi tiến hành chọn lọc callus bằng cách ngâm chúng trong dung dịch chứa độc tố xanthomonin của vi khuẩn bạc lá.
Hình 3.16: Callus xử XL phóng xạ
Nguồn phóng xạ Mẫu XL phóng xạ Callus sống sau XL
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của liều lượng chiếu xạđối với callus của các giống Tỷ lệ callus sống sót (%) Công thức (CT) HT1 N18 ĐB6 SS1 Nếp 87 CT1 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 CT2 93,0 83,3 86,5 92,5 93,5 CT3 83.3 75,0 80.3 85,0 87,0 CT4 81,8 70,0 72,5 76,0 81,0 CT5 76,6 66,6 69,5 70,5 78,5 Qua bảng 3.17 thấy rằng xử lý phóng xạ với liều lượng càng cao thì khả năng sống sót càng thấp đối với tất cả các giống thí nghiệm
* Xử lý callus trong dung dịch chứa độc tố xanthomonin
Để chọn lọc được các dòng tế bào callus đột biến có khả năng kháng được độc tố
Xanthomonin của vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa chúng tôi tiến hành ngâm callus của các giống sau khi xử lý phóng xạ trong dung dịch chứa độc tố của chủng vi khuẩn 3A (đây là chủng có
độc tố mạnh và phổ biến nhất ở miền Bắc Việt Nam). Ngâm mẫu trong dung dịch độc tố vi khuẩn khoảng 10 phút sau đó chuyển mẫu lên đĩa Petri có trải giấy lọc vô trùng cho thấm khô dung dịch vi khuẩn bám quanh callus. Sau đó cấy mẫu vào môi trường nhân callus đã chuẩn bị sẵn. Mỗi công thức xử lý 100 mẫu. Sau 1 tuần tiến hành đánh giá khả năng sống sót của callus sau xử lý dung dịch vi khuẩn, (kết quảđánh giá tổng hợp ở bảng 3.18)
Bảng 3.18. Callus sống sót của các giống sau xử lý dung dịch vi khuẩn bạc lá Tỷ lệ callus sống sau xử lý dung dịch vi khuẩn% Giống
Không XL 1Krad 3Krad 5Krad 7Krad
HT1 0,0 1,0 1,0 2,0 0,00
N18 0,0 1,0 4,0 5,0 1,0
ĐB6 0,0 0,0 2,0 3,0 0,0
SS1 0,0 2,0 5,0 6,0 2,0
- 81 -
Từ bảng 3.18 chúng tôi nhận thấy ở tất cả các giống khi không xử lý phóng xạ callus
đều bị chết và giống nếp 87 tất cả các callus đều bị chết sau khi xử lý độc tố. Các giống còn lại với liều lượng 1Krad tỷ lệ sống cũng rất thấp, từ 0% đến 2,0%. Ở liều lương 3 Krad và 5 Krad số callus sống tăng lên, dao động từ 1,0 – 5,0% và 2,0 – 6,0%. Tuy nhiên ở liều lượng 7 Krad thì chỉ có 2 giống có callus sống sót là N18 và SS1 nhưng với tỷ lệ rất thấp 1,0-2,0%. Qua đây chúng tôi cũng nhận thấy giống N18 và SS1 có tỷ lệ callus sống sót cao nhất. Điều này chứng tỏ kiểu gen cũng ảnh hướng đến sự sống sót của callus.
* Tái sinh cây sau xử lí độc tố
Các callus sống sót của các giống sau khi xử lý dung dịch vi khuẩn được cấy chuyển hết sang môi trường tái sinh ban đầu (MS + 0,2mg/l NAA + 2mg/l BAP) để callus hóa xanh và tạo chồi. Callus sau khi bật chồi tiếp tục được nuôi cấy trên môi trường: MS + 0,2mg/l NAA + 2mg/l BAP để tạo ra được nhiều chồi. Sau khi chồi phát triển mạnh (cao khoảng 5cm) thi tiến hành tách ra từng chồi nuôi cấy thành dòng, rồi cấy chuyển ra đất (kết quả tổng hợp ở
bảng 3.19)
Bảng 3.19. Callus tái sinh sau XL độc tố Xanthomonin
Số cây tái sinh sau xử lý độc tố Giống Không
XL 1Krad 3Krad 5Krad 7 Krad Tổng số
HT1 0,0 3,0 4,0 9,0 0,0 16,0 N18 0,0 4,0 13,0 16,0 3,0 36,0
ĐB6 0,0 0,0 8,0 12,0 0,0 20,0
SS1 0,0 8,0 17,0 23,0 7,0 45,0
để tái sinh cây cũng khác nhau, tỷ lệ callus tái sinh cây được trình bày ở bảng 3.19. Giống SS1 cho số cây tái sinh cao nhất với 45 cây, trong đó 8 cây tạo ra từ callus xử lý liều lượng 1 Krad, 17 cây 3 Krad, 23 cây 5 Krad và 7 cây 7 Krad. Giống N18 cũng cho lượng cây tái sinh cao (36 cây), giống HT1 (16 cây) và giống ĐB6 (20 cây
Hình 3.18: Nhân nhanh và tách chồi giống SS1
Các cây tái sinh được cấy chuyển ra điều kiện tự nhiên, cấy trong xô chứa bùn loãng thấy 100% số cây sống sót và cho hạt, hiện chúng tôi đang tiếp tục đánh giá.